荧光定量PCR：简介,原理,应用

《荧光定量PCR：简介,原理,应用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、荧光定量PCR：简介，原理，应用荧光定量PCR简介荧光定量PCR检测技术诞生至今已10多年的时间，而其应用一直都没广泛展开，究其原因，无外乎受制于相关仪器、试剂和技术的发展。近期，尤其是08年以來，仪器和试剂是遍地开花，这也使科研人员均跃跃欲试，都想借此技术使H己的研究能突飞猛进，发展势头通过查找每年所发表的文章数可一H了然。据有关统计，在Medline数据库中，用“Taqman”或”realtimePCR”作为关键词检索,1996年是19篇,1999年157篇，到2003年就高达2984篇,2009年会是多少呢？我们不得而知。但其迅猛的发展势头却是不可更

2、改的，本公司真诚希望能和众多研究人员共同努力，抓住这一大好时札为科研事业的发展贡献自身的力虽:。基于这一目标，本公可长期以來对荧光定量PCR,无论是技术还是多年來的产品，均进行了深入地研究，并及时推出更加优界的荧光定量PCR技术服务。荧光定量PCR原理荧光定量PCR最早称TaqManPCR,后來也叫Real-TimePCR,是美国PE(PerkinElmer)公司1995年研制出來的-种新的核酸定最技术。该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针或相应的荧光染料來实现其定最功能的。我原理：随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累讣，荧光信号强度也等比例増

3、加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段,扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩孟，无法判断产物量的变化。而在平台期，扩増产物已不再呈指数级的増加，PCR的终产物最与起始模板量Z间没冇线性关系，根据故终的PCR产物量也不能计算出起始DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物疑的对数值耳起始模板鼠之间存在线性关系，我们叮以选择在这个阶段进行定量分析。为了定就和比较的方便，在

4、实时荧光定量PCR技术中引入了两个菲常重要的概念：荧光阈值和CT值(如下图所示)。荧光域值(threshold)是在荧光扩增曲线上人为设定的-•个值，它可以设定在荧光倍号指数扩增阶段任意位置上，但一般荧光域值的缺省设置是PCR反应前3」5个循环荧光信号标准偏差的10倍,UP：threshold.■°%11«««»15MM图1・Ct值的确定ct值：是指每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数。Ct值与起始模板的关系：研究农明，每个模板的ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，ct值越小。利川已知起始拷贝数的标准品町作出标准Il

5、li线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵塑标代表ct值如下图所示。因此，只要获得未知样胡的ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。荧光定量检测荧光定最检测根据所使用的标记物不同町分为荧光探针和荧光染料。荧光探针又包JSBeacon技术（分子信标技术，以美国人Tagyi为代表）、TaqMan探针（以美国ABI公司为代表）和FRET技术（以罗氏公司为代表）等：荧光染料包括饱和荧光染料和非饱和荧光染料，非饱和荧光染料的典型代农就是现在最常用的SYBRGreenI；饱和荧光染料有EvaGreen.LCGreen等。嵌合荧光染料法（SYBRGreenI）

6、SYBRGreenI是荧光定量PCRM常用的DNA结合染料，与双链DNA非特异性结合。在游离状态下，SYBRGreenI发出微弱的荧光，但•旦与双链DNA结合，其荧光增加1000倍。所以，一•个反应发出的全部荧光信号与出线的双链DNA暈呈比列，且会随扩增产物的增加而增加。SYBRGreenI荧光染料与DNA双链的结合双链DNA结合染料的优点：实验设计简单，仅需要2个引物，不需要设计探针，无需设计多个探针即可以快速检验多个基因，且能够进行熔点曲线分析，检验扩增反应的特升性，低的初始成本，通用性好，因此国内外在科研中使用比较普遍。荧光探针法（Taqman技术）

7、:PCR扩増时，加入一对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针。该探针为一直线型的寡核昔酸,两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收,PCR仪检测不到荧光信号；PCR扩増时（在延仲阶段），Taq酶的5'一3'切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就冇一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，这也是定就的基础所在。其过程如下图所示TaqMan°粉荧光定量PCR的应用分子生物学研究1核酸定量分析。対传染性疾病进

8、行定量定性分析，病原微牛物或病毒含量的检测，比如近期流行的屮型H1