荧光定量PCR的原理及其应用

《荧光定量PCR的原理及其应用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、荧光定量PCR的原理及其应用蒋昌龙荧光定量PCROutline荧光定量PCR的原理荧光定量PCR应用PCR反应过程5’5’3’3’d.NTPsTaq酶Primers5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’反应组分变性5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’延伸5’3’5’3’5’3’5’3’3’5’3’TaqTaq5’5’重复退火5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’3’5’3’循环24个拷贝循环38个拷贝5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3

2、’5’3’Cycle#TheoreticalRealLifeLogTargetDNAPCR反应模式同一样品96复孔的实验结果荧光定量PCR原理缺憾无法对初始模板精确定量无法实时监测扩增情况跑胶繁琐、易污染常规PCR电泳鉴定荧光定量PCR在体系中引入荧光染料实时检测扩增阶段：指数期平台期荧光定量PCR原理荧光定量PCR原理ThresholdlineC(t)value阈值：荧光扩增曲线指数增长期设定的一个荧光强度标准C(t)值：荧光信号到达阈值时所经过的扩增循环次数荧光定量PCR原理X=X0(1+Ex)nlogX=logX0(1+Ex)nlogX0=(-log(1+Ex)

3、)*n+logXlogX0=(-log(1+Ex))*C(t)+logXc(t)n：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率初始模板的Log10值与Ct值呈线性关系！设定标准品，绘制标准曲线荧光定量PCR原理荧光强度---循环数曲线初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线10410310610510210unknown104103Ct值通过标准曲线对未知样品模板进行准确定量荧光定量PCR原理荧光定量PCR原理两种定量方法绝对定量标准曲线法相对定量双标准曲线法2-ΔΔc(t)法荧光定量PCR原理精确定量大范围拷贝数样品同时检测100—1

4、010省时有效通过浓度梯度标准品，绘制标准曲线样品结果与标准曲线比对得到精确的浓度临床检测，转基因检测，环境监测等绝对定量荧光定量PCR原理设置内标：b-actin、GAPDH等管家基因对靶基因进行均一化：靶基因拷贝／每一个内标基因拷贝双标准曲线法含靶基因与含内标基因的浓度梯度质粒分别做标准曲线；样本靶基因与内标基因绝对浓度的换算，并均一化处理；标本间靶基因的表达水平分析2-ΔΔc(t)法标本内靶基因与内标基因Ct值比较：ΔC(t)=C(t)m－C(t)n标本间ΔC(t)比较：ΔΔc(t)＝ΔC(t)1－ΔC(t)22-ΔΔc(t)计算相对定量无需制备标准品(2-ΔΔ

5、c(t)法)，需要内参照基因，注意扩增效率(内参与目的基因扩增效率相近）差异表达分析，芯片结果验证等相对定量荧光定量PCR原理插入染料法SYBRGreenI杂交探针法TaqMan荧光定量PCR原理5’5’3’3’d.NTPsTaq酶Primers5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’反应组分变性5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’插入染料方法的原理SYBRGreenITaqIDl延伸5’3’5’3’5’3’5’3’检测激发的荧光5’3’5’3’5’5’TaqTaq3’5’3’TaqTaq5’5’退火IDIDIDIDIDIDIDID

6、IDIDlllll插入染料法相对成本低不需要设计探针，通用性强对引物的设计要求较高（注意非特异性扩增）不能做多重PCRMeltingCurveanalysis逐步提高温度，读取荧光值，得到温度与荧光值的关系曲线温度荧光强度TmTm值：一半DNA解链时的温度-dIdTTmSolvethenon-specificproductMeltingcurve优化条件更换引物权宜之计95℃10sec60℃15sec72℃30sec80℃10secdetection40cycles杂交探针方法TaqMan探针分子信标探针（MolecularBeacons）荧光定量PCR原理TaqMa

7、n探针5’5’3’3’d.NTPsTaq酶Primers5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’反应体系变性5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’Taql5’3’RQProbe5’3’RQ5’3’5’3’5’3’RQ退火5’3’1.链取代Taq3’QR5’5’3’3’QTaqR5’2.水解3.聚合5’3’QTaqR3’5’4.检测荧光5’3’3’QTaqR5’l扩增特异性强可以做多重检测成本较高MolecularBeacon发夹结构退火时与靶片段结合引物延伸时被切断More…医疗领域的应用科学研究方面的应用公安系统内