实时荧光定量pcr的原理、操作及其应用

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1、实时荧光定量PCR的原理、操作及其应用------分子生物学实验技术系列讲座Ⅱ河南农业大学生命科学研究中心张志坤2009.12.7大纲一.原理概述二.操作及结果分析(一).样品制备(二).引物及探针的设计与合成(三).标准品的制备---质粒或纯化后的PCR产物(四).通道的选择及增益的选择(五).标准曲线的建立(六).加样时应注意的细节(七).阈值的选定(八).熔解曲线分析(九).操作流程三.应用(一).绝对定量分析(二).相对定量分析及实验方案(三).SNP检测分析一、原理概述1.Real-TimePCR概论实时荧光定量PCR技

2、术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。实时荧光定量PCR：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。定量PCR仪是在普通PCR仪的基础上加装了荧光激发装置和荧光检测装置，PCR扩增和检测同时进行，最终结果不需进行电泳检测，所以有效地避免了样品间的交叉污染。常规PCR技术：对PCR扩增

3、反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。一、原理概述2.定量PCR常用的三个常用概念扩增曲线、荧光阈值、Ct值(1).扩增曲线：反映PCR循环次数和荧光强度的曲线，定量PCR仪每次轮PCR扩增都会自动录荧光强度的变化每个循环进行一次荧光信号的收集一、原理概述2.定量PCR常用的三个常用概念扩增曲线、荧光阈值、Ct值(2).荧光阈值：样本的荧光背景值和阴

4、性对照的荧光值，手动设置的原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99。(3).CT值：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。一、原理概述3.荧光定量PCR所用的荧光报告基团(1).非特异性荧光标记：SYBRGreen(2).特异性荧光标记：TaqMan探针MolecularBeacon分子信标一、原理概述4.非特异性荧光染料---SYBRGreen的特性(1).SYBRGreen能结合到双链DNA的小沟部位(2).SYBRG

5、reen只有和双链DNA结合受激后才发荧光(3).变性时，DNA双链分开，无荧光(4).复性和延伸时，形成双链DNA,SYBRGreen发荧光，在此阶段采集荧光信号。SYBRGreenSYBRGreen一、原理概述4.非特异性荧光染料---SYBRGreen的工作原理图解5’3’5’3’SGNoEmissionSGSGSGExcitationSGSGSGSGSGSGSG5’3’5’3’EmissionExcitation伴随着每轮PCR的进行，特异的基因片段不断积累，SYBRGreen不断的与新增加的基因片段结合而发出荧光，荧光信

6、号不断积累，荧光定量PCR仪实时记录了荧光信号的变化。一、原理概述5.非特异性荧光染料SYBRGreen的优缺点优点：(1).对DNA模板没有选择性----适用于任何DNA(2).使用方便-----不必设计复杂探针(3).非常灵敏(4).可做熔解曲线分析(5).便宜缺点：(1).对引物特异性要求较高(2).与非特异性双链DNA结合，产生假阳性,干扰实验的准确性,尤其是分析表达量不高的基因时,这类情况尤其突出;需要不断的优化反应体系,降低非特异性扩增.一、原理概述6.TaqMan---水解型杂交探针与目标序列互补TaqMan探针的特

7、性：(1).5′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等(2).3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)(3).探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光(4).Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针一、原理概述6.TaqMan---水解型杂交探针工作原理每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光一、原理概述7.探针法的优缺点(1).极高的特异性和准确性由于探针法除了引物序列的特异性之外，还有探针序列的特异性，从两个方面保证了所扩增基因的特异

8、性。(2).良好的重复性(3).目前合成价格较贵.(4).不能做熔解曲线分析.一、原理概述8.荧光定量PCR的数学原理理想的PCR反应：X=X0*2n(扩增效率=1)实际的的PCR反应：X=X0*(1+Ex)nn：扩增反应的循环次数X：第n次循环后