实时荧光定量pcr技术原理与应用

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1、东胜创新技术通讯EastwinTechnicalNotes─────────实时荧光定量PCR专辑2004年4月综述METHODS25,383–385(2001)doi:10.1006/meth.2001.1260,availableonlineathttp://www.idealibrary.comon实时荧光定量PCRThomasD.SchmittgenDepartmentofPharmaceuticalSciences,CollegeofPharmacy,WashingtonStateUniversity,Pullman,WA991

2、64.对于从90年代初就开始接触定量PCR的实验人员来说，他们早已对繁琐的定量方法习以为常。早期定量PCR技术的难点主要在于：（1）如何确定PCR正处于线性扩增范围内（只有在此范围内PCR产物信号才与初始模板的拷贝数成比例）。（2）一旦线性扩增范围确定以后，如何找到一个合适的方法检测结果。为了保证线性，研究者要扩增一系(1)(2)(3)列梯度稀释的cDNA或者对每个基因的扩增循环数作适当的调整；有的研究者加一个竞争性模板，有的做限制性(4)(5)的稀释梯度分析，或者加一个PCR模拟（mimic）反应，即用相似的引物与目标产物共扩增。而扩增

3、产物的检测通常在跑胶以后通过染料，放射活性或者探针进行检测。对于已经开始使用实时定量PCR的研究者来说，过去的日子已经一去不复返了。在实时PCR中，不再需要担心扩增的线性和放射性污染，也不再需要跑胶和手工收集数据。现在在2到3小时之内拿到数据已经不再是梦想。除此之外，实时PCR还有其它的一些优点：灵敏度大大提高；可以实现高通量；所有实验在封闭系统内完成，可变因素大大减少；可以进行多重PCR反应，而且不需要后期处理。PCR实时检测技术从诞生到现在已经有五年了，但是其应用在近两年才开始迅猛增长。在Medline数据库中，用“Taqman”或“

4、real-timeandPCR”作为关键词搜索，在1996年有19篇文章，在1997年有28篇文章，在1998、1999、2000年文章数分别达到了52、157和409篇。在这篇文章写作的同时，在2001年已经可以找到551篇文章了。许多厂商也正在大力宣传实时荧光定量PCR仪及其相关的技术（包括软件、探针等），而且在不久的将来，会有更多的产品发布。针对实时定量PCR这一热点领域，我们收集了许多目前用实时定量PCR来定量DNA或RNA的方法，汇编成9篇文章，涵盖了从mRNA和病毒DNA定量到DNA的甲基化和单核甘酸多态性的扩增检测。Giul

5、ietti等人描述了通过实时PCR对cytokine基因表达进行定量的方法。因为这一类基因在免疫的诸多方面都起着非常重要的作用，读者会发现这篇文章非常有用，特别是文中列出了许多cytokine基因和看家基因的引物和探针序列。就象大多数方法一样，这篇文章描述的定量检测cytokine基因表达的方法可以外推检测许多不同种类的mRNA。同时这篇文章也对实时定量PCR做了一个很好的综述，包括探针的化学原理和仪器介绍。我们推荐这个领域的所有新手应该先读读这篇文章。对于DNA或RNA的常规定量来说，有两种定量方法：绝对定量和相对定量。绝对定量检测模板

6、数的精确拷贝数，通常要用到标准曲线。在Niesters的文章里讨论了绝对定量用于病毒载量分析的方法。而相对定量能给出样本间基因表达的差异，比如说经过处理的样本和未经处理的对照。通常，给出基因表达的相对变化就足够说明问题了，并不需要给出绝对量的变化。因为不要做标准曲线，基因表达的相对变化分析比绝对定量的方法更省时。对于那些想得到相-ΔΔCT对表达数据的研究者来说，Livak和Schmittgen文章中的公式对于数据分析是非常有用的。这篇文章描述了2方-ΔΔCT-ΔΔCT法的推倒、假设和2在基因相对表达分析中的实际应用。文章中也讨论了2方法的

7、两种衍生方法，以及数据1东胜创新技术通讯EastwinTechnicalNotes─────────实时荧光定量PCR专辑2004年4月-ΔΔCT分析的一些小窍门。包括表格设计等。LehmannandKreipe等人在他们的文章中将2方法用于病人标本的定量研究。cDNA芯片和差异显示是两种最常用的高通量筛选基因表达差异的技术。这两种技术的缺点在于它们只是定性而非定量分析，因而需要用一个定量的方法确认基因表达的差异，而实时PCR就是非常合适的一种手段。Rajeevan等人的文章描述了一种利用SYBR-GreenI通过实时PCR检测产物并进行

8、熔解曲线分析的方法，并用该方法对cDNA芯片和差异显示PCR技术的结果进行了确认。将实时PCR和高通量方法的结果相互比较就能对这个基因是否真的存在表达差异进行确证。相对于Taqman探针而言，