荧光定量PCR技术的原理及其应用课件.ppt

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1、荧光定量PCR技术的原理及其应用基因有限公司技术支持部张会敏实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR（real-timeQ-PCR）技术:指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过参照标准曲线对反应体系中未知模板进行量化分析的方法。定量PCR技术的产生1992年由Higuchi等人第一次报告：使用EB内插染料法插至双链DNA，经改装的带有冷CCD的PCR仪检测样品的荧光强度，后来用与双链DNA有更强结合力的染料SYBRGreenI取代EB90年代早期，发现TaqDNA多聚酶具有5’核酸外切酶活性，能在DN

2、A双链聚合过程中降解与模板互补的DNA片段（如特异性探针），因此使得间接的检测PCR产物成为可能。此后荧光双标记探针的运用使在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。这些发现以及相应的仪器和试剂的商品化发展导致real-timeQ-PCR方法在研究工作中的运用。PCR循环双链DNA染料荧光PCR的理论方程：Y=x×(1+Ev)nY：扩增物数量；X：起始模板数量；Ev：扩增效率；n：扩增循环数1.终点法定量原理：在最佳实验、循环次数n一定、Ev相同的前提下，根据扩增产物的量可以计数出反应物中原始分子数，若核酸提取效率相同（与标准品），进而计算

3、出标本中靶分子的准确含量，即：lnX=lnY-n×ln(1+Ev)=lnY-b(b为常数)2.实时检测法定量原理：在最佳实验、相同Ev以及相同扩增产物的情况下，反应物中原始分子数（X）与其所需要的扩增循环次数（n）成反比，若核酸提取效率相同（与标准品），进而计算出标本中靶分子的准确含量，即：LgX=LgY–n×Lg(1+Ev)=b-n×a(a、b为常数)传统检测起始模板的定量方法是终点检测法，即PCR快到达平台期进行检测，而不同起始模板浓度经过PCR对数期扩增到达平台期时，最后的差异极小，不仅检测不准确，而且检测重现性很差。同一个模板在96

4、孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异，因此无法直接从终点产物量准确推算出起始模板量。实时荧光定量PCR技术则是根据不同浓度的起始模板经PCR扩增后到达某一定值时所需要的循环数来计算起始模板量，克服终点法检测过程中“平台效应”对结果的影响。检测每一轮循环的荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线即可获得定量的准确结果。实时荧光定量PCR中的三个概念增长曲线(primarycurve)荧光阈值（threshold)CT值(CycleThreshold)增长曲线反映荧光强度与循环数的对应关系Cyc

5、leFluorescence域值：PCR扩增信号进入相对稳定对数增长期时的荧光值。PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的偏差的10倍。荧光域值（Threshold）的设定确定Ct值Ct值:C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定

6、的.当循环次数n=Ct时：X=X0×(1+Ex)Ct两边取对数，可以推倒出：Ct值与起始模板的关系logN=logN0+nlogEn=CtCt值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。InterpolationofrealtimegraphicaldatatostandardcurveCT值取决于阈值，阈值取

7、决于基线，基线取决于实验的质量，因此CT值是一个完全客观的参数。CT值越小，模板DNA的起始拷贝数越多；CT值越大，模板DNA的起始拷贝数越少。一般正常的CT值范围在15-35之间，过大和过小都将影响实验数据的精度。通过标准品作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量实时在线监控对样品扩增的整个过程进行实时监控，能够实时地观察到产物的增加降低反应的非特异性引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高反应的特异性增加定量的精确性准确的算法进行定量结果分析更加快捷方便，无需跑胶荧光定量PCR与普通PCR的比较荧光定量PCR标记方法

8、内掺式染料SYBRGreenI、LCGreen、EvaGreen序列特异性探针TaqmanMolecularBeaconsDualProbes(FRET)引物特异性探针Ampli