GBT 19915.8-2005 猪链球菌2型毒力因子荧光PCR检测方法

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1、ICS07.100.30C53中华人民共和国国家标准GB/T19915.8-2005猪链球菌2型毒力因子荧光PCR检测方法Protocolofreal-timePCRassayforvirulencefactorsofStreptococcussuistype22005-09-27发布2005-11-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布中国国家标准化管理委员会GB/T19915.8-2005前言本标准的附录A为规范性附录。本标准由国家标准化管理委员会提出。本标准由全国动物防疫标准化管理委员会归口。本标准由中国检验检疫科学研究院和江苏出人境检验检疫局负责起草。本标准主要起草人:林

2、祥梅、吴绍强、韩雪清、贾广乐、刘建、梅琳、陈国强、张敬友、姜众、唐泰山。本标准为首次发布。GB/T19915.8-2005猪链球菌Z型毒力因子荧光PCR检测方法范围本标准规定了猪链球菌2型毒力因子MRP和EF检测的荧光PCR操作方法。本标准适用于检测生猪拭子、增菌培养物、疑似病料及猪组织样品中猪链球菌2型菌株的致病力。2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2.1毒力因子virulencefactor猪链球菌2型菌株的致病力与其毒力因子直接相关。猪链球菌2型的毒力因子有溶菌酶释放蛋白(MRP),胞外因子(EF),溶血素、英膜多搪以及44kDa蛋白、IgG结合蛋白、纤毛粘着素等。其中，溶菌酶释

3、放蛋白(MRP)和胞外因子(EF)是最主要的两个毒力因子，可作为判定菌株毒力的指标。一般认为表型MRP+EF十为强致病株，MRP+EF一为弱致病株，MRP-EF一为非致病株，未发现MRP-EF+表型。3缩略语本标准采用下列缩略语:荧光PCR荧光聚合酶链反应MRP溶菌酶释放蛋白EF胞外因子Ct值荧光信号到达设定的闽值所经历的循环数FAM6-狡基荧光素TAMRA四甲基罗丹明4实验材料与仪器4.1实验试荆实验试剂包括:—猪链球菌2型毒力因子荧光PCR检测引物、探针、阳性对照及常规PCR反应试剂;—商品化的组织基因组DNA提取试剂盒，具体提取操作参照说明书进行。4.2仪器所用仪器包括:—荧光PCR仪

4、;—高速冷冻离心机;—台式离心机;—旋涡混匀器;—冰箱(20C^-8℃和一20℃两种);—微量可调移液器(。.1pL-2KL,2KL-201sL,20iL-200pL,100EiL-1000pL等规格)和相应配套的吸头。GB/T19915.8-2005操作方法5.1方法概要荧光PCR方法是一种快速、灵敏、特异的检测病原体的方法。本研究选择猪链球菌2型的MRP和EF两个毒力因子基因设计引物进行PCR，同时在扩增序列中间设计了荧光探针，进行多重荧光PCR检测。反应结束即可根据扩增曲线判定有无目的基因，从而确定待检菌是否含有猪链球菌2型MRP和EF毒力因子基因，并据此判定其致病力。5.2操作步骤5

5、.2.1实时荧光PCR扩增体系取1pL培养菌液或从组织中提取的基因组DNA作为模板，加人按照表1配制的PCR反应液中。表1荧光PCR反应液配制试剂体积/pL10XPCR缓冲液(不含Mgz,)2.525mmol/LMgCl23.02.5mmol/LdNTP2MRP引物及探针1.5EF引物及探针1.55U/FLTaqDNA聚合酶0.5灭菌双蒸水至总体积25pL进行待检样品扩增反应的同时，应设立标准阴、阳性菌株或DNA对照。操作时注意的问题见附录A,5.2.2PCR扩增条件将样品管放人荧光PCR仪后，设置如下条件进行反应:—94℃预变性3min;—然后采用二步法进行反应:940C5s,50`C10

6、s,40个循环，每个循环结束后采集数据。6结果判定6.1判定方法反应结束后，阑值的设定可根据仪器噪声人工调整，以阑值线刚好超过阴性样品扩增曲线的最高点为准。仪器将自动给出每个样品的Ct值。记录Ct值，分析检测结果。6.2阳性判定如果MRP的PCR扩增曲线Ct镇30，则表明为阳性，即待检菌株为猪链球菌2型致病株;对于MRP阳性菌株，以有无EF基因作为标准来判定其致病力。MRP+EF+为强致病株，MRP+EF一为弱致病株(目前未有MRP-EF+毒型的报道),MRP-EF一为非致病株。6.3阴性判定如果反应曲线Ct>40，则为阴性。6.4可疑判定如果30

7、扩增，如果重复试验的Ct<40，则判为阳性，否则为阴性。6.5无效扩增如果阳性对照没有扩增曲线，或者阴性对照有Ct<30的扩增曲线，判定本次试验无效，需要分析试验失败原因，并重新试验。GB/T19915.8-2005附录A(规范性附录)检侧过程中生物安全和防止交叉污染的措施A.1样品处理过程中必须戴一次性手套，并经常更换。PCR反应液配制过程中应在超净工作台等洁净环境中进行。A.2抽样和制样工具必须清洁干净，