GBT 19915.7-2005 猪链球菌 2型荧光 PCR检测方法

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1、ICCs5307.100.30荡黔中华人民共和国国家标准GB/T19915.7-2005猪链球菌2型荧光PCR检测方法Methodofthereal-timePCRforthedetectionofStreptococcussuistype22005-09-27发布2005-11-01实施串替裳臀瓣譬篷臀臀暴发“GB/T19915.7-2005前言本标准的附录A是规范性附录，附录B是资料性附录。本标准由国家标准化管理委员会提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口．本标准起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局

2、、中国兽医药品监察所。本标准主要起草人：张鹤晓、宋立、高志强、宁宜宝、乔彩该、王甲正、杨承槐、吴丹、谷强。本标准系首次发布的国家标准。GB/T19915.7--2005猪链球菌2型荧光PCR检测方法1范围本标准规定了猪链球菌2型荧光PCR检测方法。本标准适用于增菌培养物、疑似病料及生猪拭子、猪组织样品中猪链球菌2型的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使

3、用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T19438.1-2004禽流感病毒通用荧光RT-PCR检侧方法3缩略语本标准采用下列缩略语：荧光PCR荧光聚合酶链反应Ct值每个反应管内的荧光信号盘达到设定的阅值时所经历的循环圈数DNA脱氧核糖核酸Taq酶TaqDNA聚合醉PBS磷酸盐缓冲生理盐水4原理采用TagMan方法，在比对猪链球菌2型英膜抗原21基因（cps2J）序列的基础上，设计针对该基因的特异性引物和特异性的荧光双标记探针进行配对。探针5'端标记FAM荧光素为报告荧光基团（用R表

4、示）,3’端标记TAMRA荧光素为淬灭荧光基团（用Q表示），它在近距离内能吸收5‘端荧光基团发出的荧光信号。PCR反应进人退火阶段时，引物和探针同时与目的荃因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶的5'-3’的外切核酸酶功能将探针降解。这样探针上的R基团游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。5猪链球菌2型黄光PCR检侧实脸盆的标准化设It与曹理猪链球菌2型荧光PCR检

5、测实验室的标准化设置与管理见GB/T19438.1-2004中附录C,6试荆和材料6.1试剂除另有说明，所用试剂均为分析纯。6.1.1无水乙醇：一20℃预冷。6.1.275％乙醇：用新开启的无水乙醉和无DNA酶的灭菌纯化水配制，-200C预冷。6.1.30.0lmol/LpH7.2的PBS：配方见附录A,(121士2)'C,15min高压灭菌冷却。GB/T19915.7-20056.1.4猪链球菌2型荧光PCR检测试剂盒”：试剂盒的组成、说明及使用注意事项参见附录B,6.2仪．设备6.2.1高速台式冷冻离心机：最大转速

6、13000r/rnin以上。6.2.2荧光PCR检测仪、计算机。6.2.320C-8℃冰箱和一20℃冰箱。6.2.4徽量移液器：0.5IAL-10KL,5pL-20uL,20liL-200uL,200IAL-1000IiLa6.2.5组织匀浆器。6.2.6混匀器。7样品的采集与前处理采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。7.1取样工其7.1.1棉拭子、剪刀、银子、研钵、Eppendorf管。7.1.2所有上述取样工具必须经（121土2)9C,15min高压灭菌并烘干或经160℃干烤2ho7.

7、2采样方法7.2.1生猜拭子样品咽喉拭子采样，采样时要将拭子深人喉头及上胯来回刮3次～5次，取咽喉分泌液。7.2.2扁挑体、内脏或肌肉样品用无菌的剪刀和摄子剪取待检样品1.0g于研钵中充分研磨，再加5.0mLPBS混匀，然后将组织悬液转人无菌Eppendorf管中，编号备用。7.2.3血清或血桨用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendorf管中，编号备用。7.3存放与运送采集或处理的样本在2VC-8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，须放置一70℃冰箱，但应避免反复冻融（最多冻融3次）。采集的样品密封后，采用保温壶

8、或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。8操作方法8.1样本核咬的扭取在样本处理区进行。8.1.1提取方法18.1.1.1取n个1.5mL灭菌Eppendorf管，其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，对每个管进行编号标记。8.1.1.2每管加人1.0mL裂解液，然后分别加入待测样本、阴性对照和阳性对照各100pL，一份