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《GBT19915.9-2005猪链球菌2型溶血素基因PCR检测方法.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、ICS07.100.30一一C53溥羚中华人民共和国国家标准GBJT19915.9-2005猪链球菌2型溶血素基因PCR检测方法DetectionmethodofthehemolysingeneforStreptococcussuistype2byPCR2005-09-27发布2005-11-01实施率督留瞥臀瓣譬篷臀臀暴发“GB/T19915.9-2005Hi青猪链球菌2型是链球菌属的成员，其致病菌株可致猪链球菌病，引起猪败血症、脑膜炎等。近年来，随着我国养猪业的发展，该病流行日趋严重，给养猪业带来巨大损失。人可通过伤口感
2、染该菌，并导致死亡。溶血素是猪链球菌2型一种重要毒力因子。通过检测猪及其产品中分离菌株是否含有猪链球菌2型溶血素基因，可以作为区分猪链球菌2型无毒菌株与致病菌株的一个指标，特制定本标准。本标准的附录A为规范性附录。本标准由国家标准化管理委员会提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：陈国强、唐泰山、张敬友、姜众、王凯民、张常印、林祥梅、吴绍强、刘建、韩雪清、贾广乐、梅琳。GB/T19915.9-2005猪链球菌2型溶血素基
3、因PCR检测方法1范围本标准规定了猪链球菌2型溶血素基因PCR检测的操作方法。本标准适用于猪及其产品中分离菌株的猪链球菌2型溶血素基因的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682-1992分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1猪链球菌2型Str
4、eptococcussuistype2猪链球菌是属于链球菌属的一种细菌，根据其荚膜多糖抗原的差异，可分为1^34及1/2共35个血清型。猪链球菌2型是猪链球菌的一个血清型，不仅对猪致病性很强，而且可以感染特定的人群，是一种重要的人畜共患病病原菌。4缩略语PCRpolymerasechainreaction,聚合酶链式反应DNAdeoxyribonucleicacid，脱氧核糖核酸dNTPdeoxyribonucleosidetriphosphate，脱氧核昔酸三磷酸bybasepair，碱基对5测定方法5.1方法提要以可疑细
5、菌培养物提取的核酸，作为DNA模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，与标准分子量标记比较，来确定扩增产物的大小。5.2试剂和材料除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682-1992的灭菌双蒸水。5.2.1猪链球菌2型溶血素基因PCR反应混合物：10XPCR缓冲液2.5KL,25mmol/LM9Cl22.0p.L,2.5mmol/LdNTP2uL、上下游引物各1I}AL，用双蒸水补至20tkL。引物序列如下，其目的片段长度为495byoslyl：5'000,AAG,TTC,AAG,CCG,CAT,TT
6、A3'（1542)sly2：5'GAA,GAT,TGC,GAG,CAT,TTC,CTG3'(2036)5.2.2TaqDNA聚合酶。GB/T19915.9-20055.2.3琼脂糖：电泳级。5.2.4澳化乙锭。5.2.5酚：Tris饱和。5.2.6三氯甲烷。5.2.7异戊醇。5.2.8异丙醇。5.2.970％乙醇。5.2.10分子量标记：DL-2000.5.2.11十六烷基三甲基澳化按(CTAB）提取液：0.1mmol/LTris-HCl(pH7.5),10mmol/LEDTA(pH7.5),200CTAB,0.7mmol/
7、LNaCl,1Yo日一琉基乙醇。5.2.12TE缓冲液：10mmol/l.Tris-HCI(PH8.OMmmol/LEDTA(pH8.0),5.2.1310XPCR缓冲液：100mmol/LKCI,160mmol/L(NH4)2SO4,20mmol/LMgS04,200mmol/LTris-HCI(pH8.8)，1％TritonX-100，1mg/mLBSA,5.2.14电泳缓冲液：242gTris,57.1mL冰乙酸，100mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)，加蒸馏水至1000mL；使用时10倍稀释。5.2.15加
8、样缓冲液：0.25澳酚蓝，40％蔗糖。5.3仪器和设备5.3.1离心机。5.3.2DNA热循环仪。5.3.3核酸电泳仪。5.3.4pH计。5.3.5移液器：10liL,20p.L,100pL,l000tiL,5.3.6紫外线透射仪或凝胶成像系统。5.3.7恒温水浴锅。5.4操作步骤5.4.
