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1、ICS07.100.30C53药黔中华人民共和国国家标准GB/T19915.3-2005猪链球菌2型PCR定型检测技术MethodfordetectionStreptococcussuistype2byPCR2005-09-27发布2005-11-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布中国国家标准化管理委员会GB/T19915.3-2005月明舀猪链球菌病是链球菌属中猪源链球菌引致的猪链球菌病的总称，其病原主要有猪链球菌2型和马链球菌兽疫亚种。猪链球菌2型可引起猪败血症、脑膜炎等。人可通过伤口感染该菌，并导致死
2、亡。为控制和预防该菌引致的猪链球菌病，建立快速、特异、敏感的检测方法是当务之急。本标准是采用公认的细菌学诊断的现代分子生物学技术制定的。本标准的附录A是规范性附录。本标准由农业部畜牧兽医局提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位:南京农业大学。本标准主要起草人:陆承平、范红结、姚火春、何孔旺。GB/T19915.3-2005猪链球菌2型PCR定型检测技术范围本标准规定了猪链球菌2型的PCR的定型方法。本标准适用于由猪链球菌2型引致的病死猪分离菌的检测和定型。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的
3、引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682-1992分析实验室用水规格和试验卞法术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1猪链球菌2型Streptococcussuistype2猪链球菌是属于链球菌属的一种细菌，根据其英膜多糖抗原的差异，可分为1^-34及1/2共35个血清型。猪链球菌2型是猪链球菌的一个血清型，不仅对猪致病
4、性很强，而且可以感染特定的人群，是一种重要的人畜共患病病原菌。4测定方法4.1方法提要挑取可疑细菌培养物菌落加人PCR反应管中，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，与标准分子量标记比较，确定扩增产物的大小。4.2试荆和材料除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682-1992的灭菌双蒸水。4.2.1猪链球菌2型定型PCR反应混合物和猪链球菌2型定型套式PCR反应混合物。4.2.2TaqDNA聚合酶。4.2.3琼脂糖:电泳级。4.2.4嗅化乙锭。4.2.5分子量标记:DL-2000,4.2.6TE缓冲液
5、:10mmol/LTris-HCI(pH8.0),lmmol/LEDTA(pH8.0),4.2.710XPCR缓冲液:100mmol/LKC1,160mmol/L(NH,)zSO-20mmol/LMgSO=200mmol/LTris-HCI(pH8.8),10oTritonX-100,1mg/mLBSA.4.2.8电泳缓冲液:242gTris碱，57.1mL冰乙酸，100mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)，加蒸馏水至1000mL，使用时10倍稀释。4.2.9加样缓冲液:0.25澳酚蓝，40%蔗糖。4.2.10荚膜基
6、因PCR引物和英膜基因套式PCR引物。4.2.11阳性对照和阴性对照。GB/T19915.3-20054.3仪器和设备4.3.1离心机。4.3.2DNA热循环仪。4.3.3核酸电泳仪。4.3.4pH计。4.3.5移液器:10pL,20pL,100pL,l000pL,4.3.6紫外线透射仪或凝胶成像系统。4.4英膜墓因PCR操作步骤4.4.1PCR扩增用铂金耳钓取血平板上的可疑单菌落至含有猪链球菌2型定型PCR反应混合物的PCR管中，混匀，加人Taq酶(5U/pL)0.5liL,2000r/min离心10s，立即进行PCR扩
7、增，同时设阳性对照和阴性对照。扩增条件为:950C预变性3min;950C20s,550C30s,720C40s,30个循环;72℃延伸7min,VC保存。4.4.2PCR产物回收按SangongPCR产物回收试剂盒说明书进行。4.4.2.1在25pLPCR产物中加人100pL结合缓冲液II(bindingbufferII),混匀。4.4.2.2将混合物转移到2mL收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2min,12000g室温离心1min,4.4.2.3倒掉收集管中废液，将UNI奋10柱放置同一个收集管中，加人250pL
8、洗液(washsolution),12000g室温离心1min,4.4.2.4倒掉收集管中废液，重复步骤4.4.2.3一次。4.4.2.5取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放人同一个收集管中，12000g室温离心1min,4.4.2.6将UNIQ-10柱放人一根新的1.5mL微
