GBT19915.4-2005 猪链球菌 2型三重 PCR检测方法 - 下载地址.pdf

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1、lCub53u/.iuu.3u中华人民共和国国家标准GB/T19915.4-2005猪链球菌2型三重PCR检测方法MethodofdetectingStreptococcussuistype2bytriple-PCR2005-09-27发布2005-11-01实施率督留瞥臀裂噜臀蓬臀臀暴发布GB/T19915.4-2005-L&-．曰‘，月U青猪链球菌2型是链球菌属的成员，其致病菌株可致猪链球菌病，引起猪败血症、脑膜炎等。人可通过伤口感染该菌，并导致死亡。为了区别正常猪所携带的猪链球菌2型无毒菌株与发病猪分离的致病菌株，特制定本标准。本标准是采用现代分子

2、生物学诊断技术制定的。本标准由农业部畜牧兽医局提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：南京农业大学。本标准主要起草人：陆承平、姚火春、范红结、何孔旺。GB/T19915.4-2005猪链球菌2型三重PCR检测方法1范围本标准规定了猪链球菌2型荚膜基因（cps2)、溶菌酶释放蛋白基因（mrp)和orf2这三个毒力基因的三重PCR检测技术。本标准适用于由猪链球菌2型致病基因和致病菌株的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于

3、本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682-1992分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1猪链球菌2型Streptococcussuestype2猪链球菌是属于链球菌属的一种细菌，根据其荚膜多糖抗原的差异，可分为1^x34及1/2共35个血清型。猪链球菌2型是猪链球菌的一个血清型，不仅对猪致病性很强，而且可以感染特定的人群，是一种重要的人畜共患病病原菌。4测定方法4.1方法提要挑取可疑细菌培养物菌落，加人PCR反应管中，进

4、行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，与标准分子量标记比较，来确定扩增产物的大小。4.2试剂和材料除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682-1992的灭菌双蒸水。4.2.1cps2,mrp和orf2的上下游引物，按合成说明书使用。4.2.2TaqDNA聚合酶。4.2.3琼脂糖：电泳级。4.2.4溟化乙锭。4.2.5分子量标记：DL-2000.4.2.6TE缓冲液：10mmol/LTris-HCI(pH8.0),lmmol/LEDTA(pH8.0)04.2.710XPCR缓冲液：100mmol/LKC1,160mmol/L(NH,)2

5、S0=20mmol/LMgSOa,200mmol/LTris-HCI(pH8.8)，1％TritonX-100，1mg/mLBSA.4.2.8电泳缓冲液：242gTris碱，57.1mL冰乙酸，100ml-0.5mol/LEDTA(pH8.0)，加蒸馏水至1000mL，使用时10倍稀释。4.2.9加样缓冲液：0.25％澳酚蓝，40％蔗糖。4.2.10阳性对照猪链球菌2型HA9801株基因组DNA模板，阴性对照马链球菌兽疫亚种ATCC35246株和金黄色葡萄球菌ATCC25923株基因组DNA模板。GB/T19915.4-20054.2.11猪链球菌2型三

6、重PCR反应混合物。4.3仪器和设备4.3.1离心机。4.3.2DNA热循环仪。4.3.3核酸电泳仪。4.3.4pH计。4.3.5移液器：10tcl,,20tL,100Eil_,1000pcl_e4.3.6紫外线透射仪或凝胶成像系统。4.3.7恒温水浴锅。4.4PCR操作步骤4.4.1阳性对照和阴性对照DNA模板的提取分别将猪链球菌2型HA9801、马链球菌兽疫亚种ATCC35246株和金黄色葡萄球菌ATCC25923株接种于5％犊牛血清Todd-Hweitt肉汤培养基，37℃摇振培养18h，用革兰氏阳性细菌柱离心式基因组DNA小量抽提试剂盒提取DNA模

7、板，-20℃保存备用。4.4.2PCR扩增用铂金耳钓取血平板上的可疑单菌落至含有猪链球菌2型三重PCR反应混合物的PCR管中，混匀，加人Taq酶（2U/til,)0.7r1_,2000r/min离心10s，立即进行PCR扩增；同时设去离子水的空白对照、猪链球菌2型HA9801株基因组DNA模板的阳性对照、马链球菌兽疫亚种ATCC35246和金黄色葡萄球菌ATCC25923株基因组DNA模板的阴性对照。扩增条件为：94℃预变性5min;940C30s,550C30s,72*C40s,30个循环；72℃延伸7min,4C保存。4.4.3琼脂糖凝胶电泳在电泳缓

8、冲液中加人1％琼脂糖，加热融化后加人澳化乙锭制备凝胶，凝固后进行电泳。8川J酶切