eb病毒lmp1介导cjun2fjunb异源二聚体调控细胞周期g12fs检测点的分子机制的研究

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1、摘要目的：以鼻咽癌细胞系为研究模型，从髓病毒编码的重要癌基因LMPl入手，研究LIvIPl介导c—Jun／JunB异源二聚体形成，进而调控与与细胞周期G1／S相关的负性调节因子p16和正性调节因子CyclinDl关键基因，促使细胞异常增殖，加速肿瘤的演进，为在癌变早期阶段干预信号传导与细胞周期检测点调控失常的相关靶基因的新药物设计和基因治疗方法的建立提供理论依据。方法：根据研究目标，我们确立以下研究策略和实验方法：1．我们前期研究工作表明，髓病毒潜伏膜蛋白1通过TRAF／TRADD激活3NK信号传导途径”“，为了深化该信号传导通路的研究，利用我们建立的Tet

2、-on-LMPI-HNE2DOX定量诱导表达的鼻咽癌细胞系，用westernblot方法在鼻咽癌细胞中检测DOX诱导下LMPl介导的c—Jun和JunB的定量对比变化。2．转录因子磷酸化与去磷酸化调节是细胞信号传导通路中转录因子活性调节的重要方式；转录因子异常磷酸化，往往增强其转录活性，使靶基因表达增强。为了证明转录因子是否被磷酸化，我们进一步检测DOX诱导下LMPl介导的磷酸化c-Jun和JunB的定量对比变化。3．c—Jun和JunB属于APl家族成员，而API家族成员往往以二聚体形式发挥作用，因此，在上述研究方法的基础上，我们利用VIc—Jun／Jun

3、B双染色间接免疫荧光法联合激光共聚焦荧光显微镜和免疫共沉淀-westernblot方法，证实LMPI诱导c—Jun／JunB异源二聚体形成；同时，结合信号传导通路研究中的阻断策略，用JIP-1表达质粒阻断API上游调控基因Phospho-JNK核移位，确定DOX诱导下LMPl介导c—Jun／JunB异源二聚体形成改变，从而进一步阐明c—Jun／JunB异源二聚体在该信号传导通路中的作用。4．c-Jun／JunB作为核转录因子，其异源二聚体形式功能性活化的重要证据是其具有DNA结合活性。因此，我们进一步利用EMSA和Supershiftassay方法进一步鉴定

4、c—Jun／JunB异源二聚体是否与DNA结合以及结合能力改变。同时，结合信号传导通路研究中阻断策略，确定DOX诱导下LMPl介导c—Jun／JunB异源二聚体与DNA结合能力改变，从反面佐证c-Jun／JunB异源二聚体在该信号传导通路中的作用。5．国内外文献研究进展表明，API在p16和cyclinDl启动子区有竞争性结合位点，我们结合生物信息学方法预测API在p16和cyclinDl启动子区的结合位点，利用E～ISA和Supershiftassay方法鉴定c—Jun／JunB异源二聚体是否与DNA结合以及结合能力改变，为其对靶基因的调控提供实验依据。6

5、．转录因子的最终效应体现在靶基因的表达水平上(转录与翻译层次)，因此，在确定c～Jun／JunB异源二聚体具有与p16和cyclinDl启动子区DNA结合活性的实验基础上，我们分别采用VⅡ荧光酶报道系统，分别检测c—Jun／JunB异源二聚体对p16和cyclinDl启动予活性的调节。同时，在蛋白质水平，我们采用westernblot方法，检测其对p16和cyclinDl蛋白表达水平的调节。7．肿瘤作为一类细胞周期病，GI／S检测点经常在癌变多阶段，甚至在癌前阶段就已失调。这一点体现在与GI／S调控相关的负性调节因子p16和正性调节因子CyclinDl等关键

6、基因上，p16和CyclinDl表达失衡，使细胞周期驱动机制逐渐增强，监控机制逐渐减弱，可引发更多的GO期细胞重新进入细胞周期；更多G1期细胞加速进入S期；从而可能引发细胞异常增殖，GI／S检测点失调，导致基因组不稳定性增加，加速肿瘤的演进。因此，我们在确定DOX诱导LMPI表达的情况下，c—Jun／7unB异源二聚体具有调控cyclinDl和p16表达的实验基础上，采用流式细胞术进行细胞周期检测从而为p16和CyclinDl异常表达引起GI／S检测点调节改变提供实验依据。结果：一、髓病毒LMPI异常激活API信号传导通路，导致c—Jun／JunB异源二聚体

7、形成及其功能1．研究髓病毒LMPI诱导c—Jun／JunB表达变化研究表明，随着DOX诱导时问的延长，EB病毒LMPI蛋白表达呈时间依赖性表达增强，Phospho一7NK的表达显著升高并维持在较高水平，c—Jun和JunB的表达却逐渐减弱；而LMPI诱Vm导Phospho—c—Jun(Ser63)蛋白表达在0．5至2小时表达逐渐增强，4小时达到高峰并维持在较高水平；Phospho-c-Jun(Ser73)蛋白表达在0．5至4小时表达逐渐增强，4小时达到高峰，从8小时开始逐渐减弱。2．EB病毒LiPl介导下c-Jun／JunB异源二聚体形成利用c—Jun／Ju

8、nB荧光双色标记联合激光共聚焦荧光显微镜技术，研究发