姜黄素生物学作用细胞和分子机制的研究

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1、独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：鲎坚签字日期：型年』月』上日学位论文版权使用授权书本学位论文作者及指导教师完全了鳃大连医科大学有关保留、使用学位论文的规定，同意大连医科大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版

2、，允许论文被查阅和借阍。本人授权大连医科大学可阻将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。论文怍者签名指导教懒蒌§鲎墨≤生鍪堑签字目期：逊年』三』主舀姜黄素生物学作用的细胞与分子机制研究博士研究生：曹军指导教师：仲来福教授专业名称：生物化学与分子生物学摘要一个世纪以来，癌症的死亡率不断上升，癌症已经成为全球死亡率最高的疾病。这一现象使众多科研工作者将目光投向了化学预防剂，特别是广泛存在于食物中的植物源化合物，因为它们具有毒副作用相对低的特点，而且易被患者接受。但是由

3、于对这些天然物质的药效及其作用机制尚缺乏了解，使得这些药物难于成为主流药物。姜黄素(curcumin)，是从草本植物姜黄的根茎中提取出来的酚类色素是姜黄的主要成分，也是咖喱、芥末中的主要黄色色素，在亚洲被广泛地用于调味剂、食品色素及治疗炎症的中草药，其主要药理作用特性有抗炎、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、抗脂质过氧化、抗病毒等。在某些国家姜黄素的食用量超过100mg，day，有报道成人日食姜黄素49能减少结肠直肠癌的发生，进一步的研究表明姜黄素能防止小鼠及大鼠许多组织中肿瘤的发生，并能抑制人体实体瘤的增殖，美国国立肿瘤所已将其列为第三

4、代癌化学预防药，姜黄素已成为肿瘤预防和治疗的一个研究热点。但是姜黄素的抗肿瘤机制尚不清楚，甚至在研究中得到了相反的结果。例如，大量研究表明姜黄素具有抗氧化特性，体外细胞实验证明，姜黄素能抑制活性氧类(ROs)的生成而减轻苯并吡或过氧化氢引起的DNA损伤；另一方面，姜黄素又表现出明显的促氧化(prooxidant)特性，姜黄素能使人胃黏膜细胞和人外周血淋巴细胞ROS水平升高，进而造成DNA损伤。本研究采用不同组织来源的人肿瘤细胞HepG2细胞，HT一29细胞和SK—MEL一20细胞以及人胚肾293细胞研究了姜黄素的细胞毒性，结果显

5、示姜黄素对上述四种细胞系均有细胞毒性，并且对人结肠癌HT一29细胞和人黑色素瘤sK—MEL一2细胞株的毒性作用较大，提示其细胞毒性可能具有组织特异性，但未见明显的肿瘤特异性。我们以具有正常人肝细胞代谢酶特性的人肝癌细胞HepG2细胞作为体外模型，采用定量PcR(QPcR)和8一羟脱氧鸟苷(8．oHdG)免疫组化方法，首次提出姜黄素对HepG2细胞的核DNA(nDNA)和线粒体DNA(mtDNA)都造成损伤，呈量效关系，其损伤剂量与细胞毒作用的剂量正相关。并且mtDNA的损伤明显大于nDNA的损伤，这一结果促使我们对姜黄素作用后的

6、HepG2细胞的ROS水平和脂质过氧化物水平进行了测定，结果显示姜黄素能使HepG2细胞ROs水平和脂质过氧化物水平升高，表明姜黄素的促氧化作用是其导致HeDG2细胞DNA损伤的机制。由此我们推断，一方面，姜黄素所造成的DNA损伤是其细胞毒作用的机制，因而杀伤肿瘤细胞，具有抗肿瘤作用；另一方面，姜黄素诱导的DNA氧化性损伤，特别是mtDNA的损伤能够加重nDNA的损伤，导致原癌基因的激活及抑癌基因的失活，可能致癌、致突变，并引起细胞老化，促进肿瘤的发生。同时，单细胞凝胶电泳试验(scGE)和微核(MN)试验结果表明，高剂量姜黄素

7、能导致HepG2细胞的nDNA断裂，使HepG2细胞的微核形成率明显增加，表明姜黄素可能具有遗传毒性作用。MtDNA的损伤往往造成线粒体功能缺陷，进而引起一系列生物学效应，最终导致细胞的死亡或凋亡。因此本研究中，我们采用Hoechst33342荧光染色、电镜形态学观察、碘化丙啶(PI)单染色及AnnexinV．FITC和PI双染色的流式细胞仪方法，对姜黄素所致HepG2细胞的凋亡进行了分析，结果发现，姜黄素能引起HepG2细胞的凋亡，凋亡率与姜黄素的剂量正相关。westernblot和RT-PcR方法分析姜黄素对HepG2细胞的

8、bcl，2的蛋白和基因表达的影响，结果显示，姜黄素处理过的HepG2细胞中bcl．2的蛋白和基因的表达均无显著变化，表明姜黄素绕过了bcl一2检查点而诱导了HepG2细胞的凋亡。有趣的是，在姜黄素作用于细胞lh后，线粒体膜电位呈现剂量依赖的升高趋势，与ROS水平