大黄素对atp引起的巨噬细胞死亡的作用和机制研究

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1、南开大学硕士学位论文大黄素对ATP引起的巨噬细胞死亡的作用和机制研究姓名：刘丽军申请学位级别：硕士专业：生物物理学指导教师：李俊英20070501摘要摘要本论文以大鼠腹腔巨噬细胞(PMtp)为研究对象，利用MTT法检测巨噬细胞存活率，研究了中药大黄的单体成分大黄素(emodin)对ATP诱导巨噬细胞死亡的影响，并采用单细胞钙离子成像分析系统和共聚焦显微镜系统，以细胞内ca2+浓度变化和细胞膜通透性为指标，进一步研究了大黄素作用的机制。结果表明：胞外高浓度ATP短暂刺激(作用30rain)可诱导巨噬细胞死亡，其中5mMATP诱导

2、死亡率可达36．3％，低浓度的ATP(1mM及以下)处理对巨噬细胞的存活率没有显著影响。不同浓度ATP诱发巨噬细胞[Ca2+1i变化呈现不同动力学特征：在胞外有钙的情况下，5mMATP诱发巨噬细胞[Ca2+1i迅速升高，升高最大值为基础值的2．68倍，胞内钙离子浓度很长时『日J维持较高水平，平台期回不到基值；50p．MATP也能诱发巨噬细胞【ca”】j迅速升高，但[Ca2+li升高最大值仅为5mMAllP引起最大值的59％，然后钙离子浓度缓慢下降到基础值，整个过程大约持续约100秒。在胞外无钙的情况下，5mMATP诱发巨噬细胞

3、【ca21i短暂升高，然后很快降到基础值附近，整个过程大约持续50秒。另外，利用共聚焦显微镜检测巨噬细胞对溴化乙锭(EB)摄取程度发现：5mMATP刺激10min能显著增加巨噬细胞对EB的摄取，因为EB只能进入细胞膜破损的细胞，说明5mMATP通过活化P2X7受体在细胞膜上形成膜孑L，增加了巨噬细胞细胞膜通透性。大黄素单独作用于巨噬细胞3小时，没有发现对巨噬细胞细胞活性有影响，说明大黄素对巨噬细胞没有细胞毒性。大黄素能显著抑制ATP诱导巨噬细胞死亡，10一5M大黄素抑制了这种作用的84．7％。进一步研究大黄素对ATP引起的巨噬

4、细胞[Ca2+】i升高发现：在胞外有钙，无钙两种情况下，大黄素都能显著抑制ATP诱发巨噬细胞[Ca2+1．升高，表现为【Ca2+】i升高幅值减小，持续时间缩短，上升速率变慢，10一5M大黄素则完全抑制了5mMATP诱发巨噬细胞【Ca2+】i升高。同时大黄素能剂量依赖性地抑制ATP引起的巨噬细胞细胞膜通透性的增加。综合本文的结果，提示大黄素通过抑制P2X，受体的活化，进而抑制巨噬细胞的fca2+】i持续升高和细胞膜的通透性增加，从而抑制巨噬细胞死亡。另外，大黄素对P2Y受体也有抑制作用。关键词：巨噬细胞三磷酸腺苷细胞内自由钙离子

5、浓度P2x'大黄素AbstraetAbstractEmodinisalleffectivecompoundinrhubard，aChineseherbwhichhasbeenusedfortreatinginflammation．Inthisstudy，weinvestigateditseffectsandmechanismontheATPinducedcelldeathofratperitonalmaerophage．Forthis，wetestedthecelldeathratebyM1vrmethod，monhoredt

6、heintracellularfreeCa2+(【Ca2+】Jinasinglecellwithconfocallaserscanningmicroscope，anddetermindedtheplasmamembranepermeabilityusingconfocalmicroscope．TheresultsshowedthathigIlconcentrationofexlrcellularATPcausedcelldeathofmaerophage．ThedeathrateofPMqJat5mMATPwas36．3％．w

7、hilelowconcentration(belowlmM)ATPhadnoeffectonPM甲livability．ATPatdifferentconcentrationevokesdiversemodeofincreasein[Ca2qiinPM9：5mMATPotriggeredafastincreaseofintracellularCa2+，followedbysustainedhigllintracellarCa2+level，while50州ATPoresdtedinarapidriseinthecalciumc

8、oncentration,whichsubsidedtobasallevelswithin100seconds．InCa2+-freeliBSS．5mlVlATPcouldtriggerthetransient【Ca2+]iincrease，I'砒erthansustaine