大黄素对thp-1巨噬细胞胆固醇外流的影响及其分子机制研究

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1、学校代码10459学号或申请号密级公幵^州kf专业博士学位论文大黄素对THP-1巨噬细胞胆固醇外流的影响及其分子机制研究作者姓名：付新导师姓名：赵洛沙教授专业名称:内科学（心血管内科学）培养院系：郑州大学第一附属医院完成时间：2015年3月原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论

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3、greeofDoctorEffectsandrelatedmoleculemechanismsofemodinoncholesteroleffluxfromoxidizedlowdensitylipoprotein-loadedTHP-1macrophagesByXinFuSupervisor:Prof.LuoshaZhaoDepartmentofCardiologyTheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversityMarch2015中文摘要大黄素对THP-1源性巨噬细胞胆固醇外流的影响及其分子机制研究

4、博士研究生:付新导师:赵洛沙教授郑州大学第一附属医院心内科郑州450052中文摘要第一部分：大黄素促THP-1巨噬细胞胆固醇外流及PPAR-γ通路活化目的：动脉粥样硬化(atherosclerosis)是严重威胁人类健康的心脑血管疾病之一。巨噬细胞源性泡沫细胞在动脉粥样硬化形成和发展中扮演十分重要的角色。胆固醇摄取和外排失衡是泡沫细胞形成的一个重要原因。大黄素是一个天然的活性成分，具有广泛的抗炎、抗肿瘤、降血脂等功效。多项研究表明，大黄素具有激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)通路的功能。本研究大黄素是否可通过激活PPAR-γ通路促进

5、巨噬泡沫细胞胆固醇外流。方法：人单核细胞株THP-1应用100nmol/L佛波酯处理72小时，分化为巨噬细胞，利用细胞免疫荧光染色检测巨噬细胞表面抗原（Clusterofdifferentiation14,CD14）、CD11b和CD11c的表达。THP-1巨噬细胞加入50μg/ml的ox-LDL和30.2μCi/mlH标胆固醇，培养24小时，油红O染色分析脂质沉积。THP-1巨噬I中文摘要细胞加入50μg/mlox-LDL，培养24小时。然后加入10μg/ml载脂蛋白A-I（ApoA-Ⅰ）和不同浓度的大黄素（0、1、5和10μM）培养18小时；

6、或者加入10μg/mlApoA-Ⅰ和10μM的大黄素培养0、4、8、12、16、18和24小时。对于PPAR-γ的抑制试验，在加入大黄素之前1小时需要加入不同浓度的GW-9662（0、1、5和10μM），或者预先转染PPAR-γsiRNA（20、40和80nM的）孵育24小时后加入大黄素，继续培养18小时。PPAR-γsiRNA序列为:5’-GGAUGCAAGGGUUUCUUCCtt-3’和5’-GGAAGAAACCCUUGCAUCCtt-3’。3应用闪烁计数法检测培养液和细胞的H胆固醇，计算胆固醇流出率。抽提细胞总RNA，应用逆转录PCR法检测

7、PPAR-γmRNA表达水平变化；抽提细胞总蛋白，应用Westernblot法检测PPAR-γ蛋白表达水平变化。结果：PMA孵育72小时能够促进THP-1细胞表达巨噬细胞标志分子CD14、CD11b和CD11c，而对照细胞不表达这些表面抗原分子。PMA刺激分化的THP-1巨噬细胞和50μg/ml的ox-LDL共同孵育后18小时后，细胞内形成脂滴，油红O染色呈现红色圆形颗粒状。不同浓度的大黄素（1、5和10μM）处理ox-LDL刺激的THP-1巨噬细胞18小时后，PPAR-γmRNA/β-actinmRNA的比值分别为：1.592±0.256，2.

8、571±0.193，3.591±0.218与对照组相比（1±0.191）均显著升高。大黄素对PPAR-γmRNA表达的促进作用从4小时开