富血小板血浆与12c25双羟维生素d3对骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化的影响

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1、上海交通大学博士后研究工作报告(中文摘要)富血小板血浆与1，25双羟维生素I)3对骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化的影响博士后冯勇导师张长青教授第一部分骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定目的分离、培养及纯化入骨髓间充质干细胞(hBMSCs)，并进行鉴定。方法采用髂骨穿刺抽取骨髓，密度剃度离心法提取、分离hBMSCs进行培养，倒置相差显微镜观察原代及传代培养的hBMSCs的生长情况，荧光激活细胞分选术鉴定细胞表面分子，体外诱导其向成骨、成软骨、成脂肪分化。结果1、llBMSCs在接种48dx时后，贴壁细胞呈梭形、多角形、成纤维细胞样形态，大小均一；传代培养

2、细胞形态更加均一，呈克隆样生长。2、hBMSCs表面标记鉴定：第2代纯度可达98％以上，其细胞表型CD34、CD45为阴性；CD29、CDl05为阳性。3、hBMSCs经体外诱导后可以向成骨、成软骨、成脂肪分化。结论密度剃度离心法是提取、分离hBMSCs的好方法，hBMSCs易于体外分离培养，增殖旺盛，能够保持间充质干细胞的生物学特性，经体外诱导后可以向成骨、成软骨、成脂肪分化。关键词骨髓间充质干细胞；黏附细胞；免疫表型；分化；密度剃度离心中图分类号R685．4第二部分富血小板血浆的制备、鉴定目的探讨二次离心法制备富血小板血浆(PI冲)的效果，并对其进

3、行鉴定，为PRP的使用奠定基础。方法从3位志愿者肘前静脉取血35ml，采用Landesberg法制备PRP，对其进行血小板计数，酶联免疫吸附试验测定活化后转化生长因子．131(TGF．131)与血小板源性生长因子(PDGF)浓度，扫描电镜观察活化PI冲的形态学变化。结果Landesberg法制备的PRPqbIflLd,板浓度较正常5倍以上，活化后可释放高浓度的TGF．13l和PDGF，其量与PRP中所含的血小板浓度呈正相关。扫描电镜观察PRP活化后，血小板表面有许多颗粒状突起。结论Landesberg法是制备Pl冲的可靠方法，Pl冲活化后会释放大量的生

4、长因子，且与其所含的血小板浓度呈正相关。上海交通大学博士后研究工作报告(中文摘要)化关键词富血小板血浆；血小板；转化生长因子；血小板源性生长因子；活中图分类号R685．4第三部分富血小板血浆对骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化的影响目的研究富血小板血浆(PI冲)对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)增殖与成骨分化的影响，为RPP的体内外研究及应用提供依据。方法髂骨穿刺采集、分离及培养hBMSCs，Landesberg法制备PI冲，按其较正常血小板浓度依次稀释为PRP．4．5x，PRP．3．5x，PRP．2．5x，PRP．1．0x，CCK．8法检测不同浓度PI

5、冲对hBMSCs增殖的影响，碱性磷酸酶(ALP)活性，实时定量RT-PCR检测成骨细胞分化标志物基因Runx2，Osx，COLlAl，OPN，ALP的mRNA表达，Western印迹检测R嗽2蛋白表达变化。结果不同浓度PRP对hBMSCs增殖均有促进作用，以PRP．1．0)【和PRP．2．5x最为明显，PRP抑制了ALP活性，抑制了成骨细胞分化标志物Runx2，Osx，COLlAl，OPN，ALP基因的mRNA表达和Runx2蛋白的表达。结论PRP促进了hBMSCs的增殖，低浓度更利于细胞增殖，PRP抑制了‘11BMSCs的成骨分化。关键词富血小板血浆

6、；生长因子；增殖；成骨分化；骨髓间充质干细胞；中图分类号R685．4第四部分富血小板血浆与1,25双羟维生素D3对骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化的影响目的研究富血小板血浆(PRP)与l，25双羟维生素D3(1,25(OH)2D3)联合作用对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)增殖与成骨分化的影响，为两者在体内外的联合应用提供实验依据。方法髂骨穿刺采集、分离及培养hBMSCs，Landesberg法制备PRP，将PRP．1．0)【与l，25(OH)2D3(50riM)联合作用于hBMSCs，采用CCK．8法检测对增殖的影响，碱性磷酸酶(ALP)活性与染色，

7、实时定量PCR及Western印迹检测成骨细胞分化标志物Runx2，Osx，COLlAl，OPN，ALP的表达；PRP．1．0x与1,25(OH)2D3序贯作用检测ALP活性的变化。结果PI冲一1．o)【促进了hBMSCs增殖，1,25(OH)2D3联抑制了细胞增殖，两上海交通大学博士后研究工作报告(中文摘要)者联合作用时细胞增殖介于两者之间。PRP-1．o)【与1,25(OH)2D3联合作用促进了ALP活性与染色，促进了骨细胞分化标志物Runx2，Osx，COLlAl，OPN，ALP的mRNA与蛋白的表达，两者序贯作用对ALP活性的影响证实了此种协同

8、作用与两者加入的顺序有密切关系。结论PI冲与1,25(OH)2D3可协同刺激了hBMSCs的成