腺病毒介导的vegf启动子cdtk融合基因系统的构建和体外抑瘤的研究

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1、中文摘要研究背景自杀基因疗法愁利用基因工程技术将一些病毒或细菌潜原核生物含舂_纛穗孽t裁壤缨戆中不含套或表达承乎投{聂黪藩药转换酶蒸霾导入瓣瘗缅胞进行表达，其产物(前药转凝酶)使无毒憾豹前药变成细胞毒物质，从而达到杀伤肿瘤细胞作用。该疗法通过直接杀伤效应和努观者效应杀伤肿瘸细胞，而对礁常机体细胞损伤轻微，因此能够在获得良好肿瘤治疗效聚瓣圈露鹤显醛羝全囊毒副爱应，蟊裁纛藏为耱瘩基辫澹疗磅究敬前沿谍题。遗今研究最为深入的两大自杀基因系统是HSV．TK／GCV和CD／5。FC。美国FDA已经批准多项有关HSV．TK／G

2、CV和CD／5--FC的临藤治疗实验方案。签予不嚣类受黪瘗缨腿对爨蓉基嚣系统鑫奄敏感洼不嗣、单一翻杀基因系统治疗时部分肿瘤细胞易产生耐药以及CD／5一FC耨HSV．TK／GCV系统的作用机理具有很强的互补性，联合应用CD／5一FC和HSV-TK／GCV两系统不仅可以提商肿瘤细胞杀伤作用，改潜治疗效果，瑟且露跌扩大黪瘸浚疗谱，减少瓣菱瑷象发生。舀杀基因疗法蘩求自杀基囡髓在瓣瘤细胞特异性表述瓤不在正常细胞中蔽达，一个能达到这一目的的方法是利用肿瘤组织特异性调控元件(启动子或增强子)调控自杀基因表达，如甲胎蛋白基因启动

3、子用于肝癌叁蓉基嚣疗法、erbB2痘动子用于翼腺癌象蓉基医疗法镣。瞧是这些启动孑仅针对菜一炎墅瓣癯，寂耀其有一定髑限性。盘管肉皮细胞生长因子(VEGF)几乎在所有实体瘤细腻中都有过擞表达，而正常组织中不表达或表达甚微，咀VEGF启动子驱动自杀基因，可使自杀基因在肿瘤细胞特舅瞧表这，达到懿自治疗l乍髑，两且几乎可以应用于鼹霄实{奉瘗。癌蓉基因疗法大多敬病毒律为载俸。最常用的自杀鏊疆病毒载体裔腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒和逆转录病毒等。腺相关病毒载体容量小，插入的外源基因小于4．7kb而且病毒滴度低(<104／m

4、1)：单纯疱掺病毒容易引起急性绷腿损害虽可转变成野生型，具有嘻毒枣经。陡，主要耀予神缀系统疾病；逆转录瘫毒的矫源墓因能麓梳整合入密主细缒，函戴具有效癌性，另外它只感染分裂期细胞而且瘸毒滴度低(仪106～108／m1)。而腺病毒作为载体熙有以下优点：1)病毒滴度商f1010～10”／mJ)；2)感染藏毽广，不毽可感染分裂期细腿，两虽可感染静怠期细胞；3)感染细腿时一，一其DNA不整合到宿主染色体中，没有潜在的致癌危险；4)可插入7～8kb的外源DNA片段；51可用于体内基因直接转移等生物学特点，因此腺病毒被广泛应用

5、于各种基因治疗，特别是肿瘤自杀基因治疗。在细菌内同源重组法发现以前，制各重组腺病毒仅在少数实验室能完成。随着分子生物学和基因工程技术的发展，腺病毒的制备已经相对简化，特别是在应用AdEasier一1系统以后，重组腺病毒的制备可以在一般实验室开展，因此腺病毒载体的应用日益广泛，目前已成为自杀基因疗法的首选载体。基于以上研究，本课题拟构建腺病毒介导的VEGF启动子一CD／TK融合基因系统，并观察该重组腺病毒对LOVO细胞的体外杀伤作用，为进一步开展腺病毒介导CD／TK融合基因靶向治疗大肠癌的研究提供实验依据。目的一、

6、应用AdEasier-1系统制各含VEGF启动子驱动的CD／TK融合基因的重组腺病毒质粒，经293细胞包装、扩增获取重组腺病毒。行氯化铯密度梯度离心纯化，并行PCR鉴定。二、应用含VEGF启动子驱动的CD／TK融合基因的重组腺病毒感染LOVO细胞，在前药5一氟胞嘧啶(5-FC)和／或更昔洛韦(GCV)作用下，测定肿瘤细胞的细胞克隆形成率和细胞存活率以观察腺病毒介导的CD／5一FC和HSV—TKJGCV系统对大肠癌细胞的体外杀伤效应。方法一、构建转移质粒pAdtrack-VEGFP．CDglyTK首先，用NotI和

7、WhoI切下pEGFP．1．SV．VEGFP上的VEGFP，亚克隆至pAdtrack构建pAdtrack—VEGFP。再分别以JMl09细菌和pREP8．TK为模板，PCR扩增出CD和TK基因片段，亚克隆到中间载体pcDNA3构建含CDglyTK融合基因的pcDNA3一CDglyTK。用HindIII和P饥II酶切，回收纯化一大小约2．6kb、含polyA尾的片段CDglyTK．pA，插入到穿梭质粒pAdtmck—VEGFP上构建转移质粒pAdtrack—VEGFP．CDglyTK，行酶切鉴定。二、构建重组腺病毒

8、质粒pAdEasy．VEGFP．CDglyTK用PmeI酶切线性化pAdtrack-VEGFP—CDglyTK，转化用氯化钙法制备的AdEasier-1感受态细菌，使pAdtrack-VEGFP—CDglyTK和腺病毒基因组pAdEasy--1在BJ5183细菌内进行同源重组。抽提质粒，行电泳和PacI酶切鉴定获取正确的重组腺病毒质粒pAdEasy—VEGFP·CDgly