腺病毒介导VEGF基因在人骨髓基质干细胞中的表达

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1、腺病毒介导VEGF基因在人骨髓基质干细胞中的表达作者：陈滨，宋艳斌，李玉华，裴国献【摘要】［目的］体外培养人骨髓基质干细胞(hBMSc)，将VEGF165基因腺病毒载体共转染hBMSc，观察其表达。［方法］共转染实验分为3组：VEGF165和eGFP转染组、空腺病毒载体转染组和未转染组。取重组腺病毒AdVEGF165(MOI=20pfu／cell)感染hBMSe。荧光显微镜下观察eGFP的表达，判断感染效率及细胞生长情况，RTPCR检测，ELISA和Westernblot检测分别用于观察基因转染的表达。［结果］MOI=20pfu的转染率已达80％以上，取此值为转染滴度

2、。提取出的总RNA质量较好。以双链cDNA为模板扩增VEGF165基因，产物经1％琼脂糖凝胶电泳，均可见到549bp(GAPDH)2条带。转染组可见VEGF165表达，空载体组和空白对照组未检测到VEGF165表达。ELISA结果显示基因转染组与转染空载体组和未转染组结果差异呈显著性(P<0.05)。Westernblot显示：转染组在50KD处出现特征性条带，而空载体组和空白对照组未见条带。［结论］外源性VEGF基因在人骨髓基质干细胞(hBMSc)内获得稳定表达，在本实验条件下培养的hBMSc具有典型成骨细胞的形态学特征和较强的生物学活性，向成骨细胞方向分化效率较

3、高，细胞数量可以满足骨组织工程研究的要求。【关键词】骨髓基质干细胞；VEGF；绿色荧光蛋白；基因转染10Abstract：［Objective］ToinvestigatethepossibilityofstableexpressionofVEGF～65inhumanbonemarrowstromalcell.［Method］hBMScweredividedintotransfectiongroup,emptyvectorgroupandcontrolgroup,hBMScwereinfectedwithAdVEGF165(MOI=20pfu).ThehBMScproli

4、ferationandtransfectionefficiencywereconfirmedbyfluorescencemicroscope.TheexpressionofVEGF165geneofculturedhBMSctransfectedwithVEGF165genewasassayedbyRTPCR,ELISAandWesternblot.［Result］VEGF165genewasamplifiedwithRTPCR.GAPDHgene(internalcontrol)waslocatedat549bpinthethreegroups,VEGF165gen

5、ewaslocatedat500bpintransfectiongroupbutnotintheothergroups.ELISAassayshowedthattheexpressionhadsignificantdifferenceinthetransfectiongroupcomparedwiththeemptyvectorgroupandcontrolgroup(P<0.05).Westernblotassayshowedspecific50KDtrace.［Conclusion］ExogenousVEGFgenewasstablyexpressedinhB

6、MSc,hBMScculturedunderconditionsinthisexperimentstudyshowedtypicalmorphologicalcharacteristicsofosteoblastandstrongbiologicalactivity.DifferentiationefficiencytowardsosteoblastWAShigh,andthecellamountcouldmeettheneedsofbonetissueengineeringresearch.10Keywords：bonemarrowstromalcell;VEGF;gr

7、eenfluorescentprotein;genetransfection来源于成人骨髓的hBMSc具有间充质干细胞的特性，有较强的增殖能力和向多种间充质细胞分化的潜能，虽然数量稀少，但来源充足，取材方便安全，成骨能力确切，在特定条件下可大量扩增并向成骨细胞定向诱导分化，且自体细胞移植无免疫排斥反应，可能成为理想的骨组织工程种子细胞来源，受到了广泛的关注。目前从小动物到灵长类动物BMSc向成骨细胞定向诱导分化技术已经取得了可喜的成效，但建立hBMSc规范、安全、高效的体外培养增殖方法的研究刚刚起步，因此需要进行进一步研究。本