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1、腺病毒介导脑源性神经营养因子基因在培养的雪旺细胞中的表达【摘要】观察腺病毒介导人脑源性神经营养因子(brain-derivedneurotrophicfactor,BDNF)基因在培养的雪旺细胞(Schwanncell,SC)中的表达，为视神经损伤修复提供可靠的组织工程用的种子细胞。方•法：在293细胞中培养扩增BDNF重组腺病毒(adenovirallydeliveredBDNF,Ad-BDNF),采用蚀斑形成试验测定其感染滴度。体外培养SD大鼠源性的SC,以Ad-BDNF感染培养的SC,用逆转录一聚合酶链反应(reversetranscriptasepolymersechainreac
2、tion,RT-PCR)检测BDNFmRNA的表达，用免疫印迹技术(immunoblotassay,WesternBlotting)和酶联免疫反应检测(enzyma-1inkedimmumosorbentassay,ELTSA)培养液上清中BDNF的表达。结果：Ad-BDNF经扩增后可获得较高感染滴度的重组腺病毒载体。在正常培养条件下未经Ad-BDNF感染的SC低表达BDNF,而感染3d后的SC其BDNF表达明显升高，表达量随时间延长而增加，并能在感染2Id后仍维持高表达趋势。结论：Ad-BDNF可以介导BDNF基因转染到培养的SC中，后者可以在较长时间内高效表达RDNFo【关键词】视神经
3、损伤0引言视神经作为特殊分化的中枢神经，其损伤后局部微环境中的神经营养因子(neurotrophicfactor,NTF)在其修复和再生的过程中发挥了重要作用，脑源性神经营养因子(brain~derivedneurotrophicfactor,BDNF)就是较早被肯定的其中之一［1］。在体内和离体实验中已证实，BDNF可维持、促进外周神经崎和外胚层基板来源的多种感觉神经元的发育、生长和分化［2］,支持视网膜神经节细胞(retinalganglialcell,RGC)的体外存活［3］,在治疗神经系统疾病和视神经损伤中有重要意义。雪旺细胞(Schwanncell,SC)的BDNF基础分泌量很有
4、限［4］,采用基因转染技术可使SC具有高效分泌BDNF的能力，再将其通过组织工程学的方法移植到视神经损伤部位，既能维持BDNF的有效作用浓度达到促进视神经修复和再生的目的，又能避免BDNF给药途径上的不便。目前，采用腺病毒载体介导实现BDNF基因在体外培养的SC中表达的研究尚未见报道。我们采用载有人BDNF基因的重组腺病毒(Ad-BDNF)感染SD大鼠源性SC,从mRNA和蛋白分子表达水平检测BDNF基因在SC中的表达情况并探讨其进一步意义。1材料和方法1.1材料所用Ad-BDNF系与中国军事医学科学院基础医学研究所合作研制，本实验室保存，293细胞系本实验室保存。山羊抗S-100多克隆抗
5、体、兔抗BDNF多克隆抗体（SataCruz公司）,Trizol总RNA提取液和RT-PCR反应试剂盒（Invitrogen公司）,BDNF蛋白ELISA检测试剂盒（Promega公司），新生SD乳鼠购自第四军医大学实验动物中心。1.2方法1.2.1Ad-BDNF的扩增及滴度测定正常培养的293细胞密度达到90%汇合时，加入适量Ad-BDNF液,更换为含50mL/L新生牛血清的DMEM培养液继续培养3~5d,收集出现细胞病变效应（cytopathiceffect,CPE）的293细胞,在-80°C和37°C之间反复冻融3次，离心弃沉淀，病毒上清再经CsCl线性密度梯度超速离心纯化后收集分装
6、于-80°C保存备用。Ad-BDNF的感染滴度采用蚀斑形成试验测定。1.2.2SD大鼠源性SC的培养将7日龄SD乳鼠脱颈处死后，剪取双侧坐骨神经用含青霉素、链霉素（均为500kU/L）的PBS溶液浸洗、去除血污。神经组织加入2.5g/L胰蛋白酶、2g/LI型胶原酶混合消化60min后终止,100目筛网过滤,收集滤液，1000r/min离心5min,沉淀加入含100mL/L胎牛血清的DMEM培养液重新悬浮，采用双30min差速黏附法接种细胞，置于37°C,50mL/LC02条件下培养。接种24h后向培养液中加入10-5niol/L/阿糖胞苜抑制成纤维细胞生长，24h后吸弃，更新培养液继续培养
7、，以后3d更换1次培养液，至细胞融合后以2.5g/L胰蛋白酶消化传代。采用山羊抗S-100多克隆抗体免疫细胞化学进行鉴定。选用第3〜4代的细胞用于实验。1.2.3Ad-BDNF感染SC取密度为5X108/L的SC悬液2mL接种到6孔板孔内，当细胞密度大于80%时，吸弃培养液，根据不同MOI计算所需的病毒量，取相应体积的Ad-BDNF液加入孔内，37°C,50mL/LC02条件下感染SC,90min后吸弃，更换为正常培养液
