人重组il22蛋白的表达与其生物学特性的初步分析

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1、入重组lL也2蛋白豹袭达及其生物学特性的蠲步分耩孛文稿簧人重组IL．22蛋白的表达及其生物学特性的初步分析中文摘要白细胞介素22作为IL．10细胞因子家族的成员之一最初发现于2000年。其在体内的主要来源是活化后的Thl细胞以及NK细胞。IL．22通过其异源二聚体的受体复合物表现其生物学活性。其受体属于II型细胞因子受体超家族，分别为IL．22R1和IL．10R2。静息状态下或者活化后的免疫细胞中均不表达IL．22R1，而包括T细胞、B细胞、NK细胞等在内的免疫细胞对IL．22的激发也不产生相应的作用。而在皮肤、肾、消化道、呼吸系统等组织中的细胞是IL．22的靶细胞。几．22的生

2、物学功能包括提高机体抵抗微生物入侵、保护组织抵御损伤以及修复非免疫系统组织等。除此以外IL．22还可以介导肿瘤细胞对血清淀粉样蛋白、结合珠蛋白、a．1抗胰凝乳蛋白酶等急性反应期蛋白表达上调。这些发现表明IL．22是一种新型的免疫分子，是由免疫细胞产生但起着调节组织抵御损伤和外源病原体感染的保护作用。1．人白细胞介素22的克隆及原核表达根据NCBI数据库中的人几．22基因序列设计合成了去信号肽IL．22成熟链基因片段的特异性引物。采用RT-PCR的方法从人外周血PHA刺激活化的T细胞中克隆扩增了人IL．22去信号肽基因片断。应用BamHI单酶切酶切载体和目的基因片断，胶回收酶切产物

3、后以T4连接酶连接。连接产物转化大肠杆菌Topl0，经酶切和煮菌PCR验证阳性克隆。测序正确后，抽提质粒重新转化至宿主工程菌株M15。在LB细菌培养基中大量扩增M15工程表达菌，经IPTG诱导表达产生hlL．22／His重组蛋白。经过SDS．PAGE电泳鉴定重组蛋白以包涵体的形式存在。包涵体经过超声波裂解和离心，沉淀变性和复性后经亲和层析柱纯化。实验结果表明，纯化后的IL．22／His融合蛋白纯度可达94％以上。应用SDS．PAGE和WesternBlotting对融合蛋白进行鉴定，在相对分子量约为18kd的位置为人IL．22特异性条带。人重组IL．22蛋白的表达及其生物学特性的

4、初步分析中文摘要2．人重组IL．22蛋白生物学特性的初步分析根据NCBI数据库中人Gadd45b(GrowtharrestandDNA．damage45beta)、Gadd459(growtharrestandDNA-damage45gamma)、SerpinA3(serpinpeptidaseinhibitor,cladeA，member3)以及SAA2(serumamyloidA2)基因序列设计合成Real．TimePCR引物。对人肝癌细胞株HepG2、人结肠癌细胞株SW480分别加入终浓度为100ng／ml的人重组IL．22及商品化人IL．22蛋白进行体外激发。于规定时间点

5、收集细胞并使用Trizol抽提细胞TotalRNA进行逆转录。以相当于100ngT0talRNA逆转录的eDNA为模板进行PCR检测在上述细胞株上Gadd45b、Gadd459、SerpinA3、SAA2mRNA的表达。结果显示通过原核表达并纯化的人重组IL．22与商品化人IL．22蛋白均能刺激上述细胞中相关基因的表达上调。由此表明，本实验所研制的人重组IL．22具有良好的生物学活性。综上所述，本项研究我们成功地应用原核表达系统表达出了人IL．22重组蛋白，并进行了生物学活性的初步研究。所表达的蛋白具有良好的生物学活性，为进一步研究人几．22分子在肿瘤中的作用提供了有价值的生物材

6、料，具有潜在运用价值。关键词：人白细胞介素22；重组蛋白：原核表达；包涵体纯化；实时荧光定量PCRⅡ硕士研究生：李刚导师：卢斌峰张学光ExpressionandB——iolog—i—ca—l—A—c—tiv——ity—．．．．．o．．．f．．．．．R．—．．e．．．．c．．．o．．．m．．．—．．b．．．．i．．n．．．．a．．．n．．．．t．．．．H．。．．．u．．．．m．．．．．．a．．．．n．．．．．I．．．L．．．．-．．．2．．．2．．．．．．P．．．．r．．o．．．．t．．e．．—in—AbstractandBiologicalActivityofRecombinan

7、tHumanIL．22ProteinAbstractInterleukin(IL)．22，discoveredin2000，isamemberoftheIL-10familyofcytokines．ThemajorsourcesofIL一22areactivatedThlandNKcells．IL·22actsviaaheterodimericreceptorcomplexconsistingofIL一22R1andIL一10R2．Neitherrestingnoractivat