小麦wk蛋白激酶互作候选蛋白的初步验证及其分子生物学特性分析

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1、独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得宁夏大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：厅、帆弘f弓年6月f日关于论文使用授权的说明本人完全了解宁夏大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意

2、宁夏大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：导师签名：时问：五彤年乡月7曰；0时间：j口，；年∥月／H、，■4p10瓜弼弋扬那捅晏高等植物在生长过程中经常受到干旱、高温、低温、高盐等非生物的胁迫，植物能够快速感知这些不良环境的变化且主动适应，而适应的过程就涉及到细胞内与细胞问的信号传递。蛋白质的磷酸化和去磷酸化是生物体内能量代谢以及信号传递中的重要生化反应，而蛋白质的磷酸化主要是在蛋白激酶的催化一1-完成的。对小麦蛋白激酶的研究将为小麦的生理代谢和耐胁迫性的机制提

3、供有利的依据。本实验以小麦中蛋白激酶WK为诱饵通过酵母双杂交筛选得到WD40和MAPK3蛋白，主要验证WK与WD40和MAPK3之间的相互作用，并对WD40和MAPK3分别进行了表达特性分析、组织特异性分析以及亚细胞定位分析，主要获得的研究结果如下：(1)将WD40与MAPK3的全长基因分别构建到了pGADT7载体上，WK构建到pGBKT7的载体上，进行酵母双杂交验证其互作，结果在SD／-Ade／-His／-Leu／．Trp／X．gal显蓝板上有菌落生长并显兰，经过测序比对证明是阳性克隆，表明WD40、MAPK3和WK在酵母体内是互作的。

4、(2)小白麦经过低温、干旱、ABA、NaCI胁迫处理后，以各处理小白麦的eDNA为模板对WD40进行了瞬时表达分析，经过ABA、干旱、NaCI、MeJA胁迫处理小白麦后，以各个处理后小白麦的eDNA为模板对MAPK3进行了瞬时表达分析。结果表明干旱在转录水平上对WD40有明显的上调作用，在转录水平上MAPK3对ABA，NaCl胁迫有强烈的响应。(3)分别将WD40与MAPK3构建到了绿色荧光蛋白GFP上，利用基因枪介导法轰击洋葱表皮，培养后在荧光聚焦显微镜下观察定位情况，用GFP做的空对照在整个细胞内都有信号，而WD40只有在细胞核中才能

5、看到荧光，MAPK3在细胞膜和细胞核中都能看到，结果表明WD40定位在细胞核中，MAPK3定位在细胞膜和细胞核上。(4)将WD40与MAPK3分别构建到了真核表达载体PBll21上，并转到了农杆菌C58C1中，运用农杆菌侵染花序法将WD40与MAPK3转到野生型拟南芥中，用50mg／Lkana抗生素进行筛选，获得14个WD40转基因株系，10个MAPK3转基因株系，并且已繁殖到T】代，为后续抗性鉴定奠定了坚实的基础。关键词：蛋白激酶，酵母双杂交，蛋白磷酸化，亚细胞定位，非生物胁迫AbstractAbioticstresssuchasdro

6、ught，extremetemperatureandhi曲saltseriouslyaffectplantgrowthandproduction，plantswe佗evolvedtoadapttotheseenvironmentstresses．Intheprocess，thesignalWaStransmittedbominintracellularandextracellular．Phosphorylationanddephosphorylationofproteinsareimportantbiochemicalreactionsi

7、nvolvedintheenergymetabolismandsignaltransmission．Inaddition，thephosphorylationofproteinsiscomplishedbyproteinkinases．What’Smore，researchonproteinkinasesofwheathavegreatmeaningforthemechanismofphysiologicalmetabolismandstressresistance．Thisstudyfocusesontheidentificationo

8、ftherelationshipthatWKinteracts、ⅣithWD40andMAPI妇respecfivelgwhichwerescreenedbyyeasttwo-hybridwi