犬贾第虫tert互作蛋白的筛选及验证

《犬贾第虫tert互作蛋白的筛选及验证》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、犬贾第虫TERT互作蛋白的筛选及验证ScreeningandIdentificationofInteractionProteinofGcTERT作者姓名：吴娜专业名称：预防兽医学指导教师：张西臣学位类别：农学硕士答辩日期：2015年6月6日本研究受国家自然基金项目资助（资助号No.31272550，30970322）ThisstudywassupportedbyNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.31272550，30970322)中文摘要犬贾第虫TERT互作

2、蛋白的筛选及验证贾第鞭毛虫（Giardia）简称贾第虫，内膜系统非常简单，只有内质网（ER）和次级囊泡（PVs），是一种原始的真核生物，堪称模式生物。贾第虫是一种呈世界性分布的人兽共患原虫，宠物犬、警犬、伴侣动物等都增加了人与贾第虫的接触，犬贾第虫(G.canis)对人的健康构成了严重的威胁，但是由于贾第虫的分子生物学特性及虫体细胞调控机制至今尚不清楚，迄今为止尚无防治贾第虫病的理想办法。因此研究贾第虫细胞和分子生物学，揭示贾第虫细胞分子生物学特性，寻找新的药物作用靶位，已迫在眉睫。端粒酶及其相关蛋白的发现为

3、深入研究细胞分子生物特性及药物疫苗靶位等开辟了新的研究领域。随着端粒酶研究的深入，hGar1p、hNhp2、hNhp10、PinX1、Hsp90、Hsp23、KIP等端粒酶相关蛋白已被报道，这些蛋白与端粒酶活性密切相关。目前，端粒酶相关蛋白的研究主要集中在哺乳动物，寄生虫端粒酶相关蛋白研究报道很少。本研究以模式生物贾第虫为研究对象，通过酵母双杂交系统筛选犬贾第虫TERT保守结构域—TRBD互作蛋白，并通过pull-down和Co-IP试验验证。犬贾第虫端粒酶的互作蛋白的获得，有助于阐述贾第虫生物学特性及虫体细

4、胞调控机制。贾第虫作为良好的生物模型，其端粒酶互作蛋白的筛选及研究，对真核生物端粒酶、端粒酶逆转录酶及其互作蛋白的研究具有重要意义。贾第虫酵母双杂交cDNA文库的构建本研究用Trizol法手提犬贾第虫滋养体7总RNA，构建了酵母双杂交cDNA文库，文库滴度为2.3×10cfu/ml，文库库容为95.5×10cfu，文库插入片段主要分布在1-2kb，重组克隆阳性率≥85%，文库质量较好，可用于酵母双杂交文库的筛选。犬贾第虫TERT互作蛋白的筛选构建诱饵质粒pGBK-GcTRBD，经自激活和毒性作用检测，诱饵蛋白

5、无自激活和毒性作用，然后进行文库宿主菌和诱饵菌株的杂交培养，筛选TERT互作蛋白，获得2个候选阳性菌，经测序比对，确定候选捕获基因是复制因子亚基1和二硫键异构酶4。蛋白相互作用的验证原核表达His-PDI-4蛋白、真核表达GFP-TRBD蛋白，pull-down试验验证两种蛋白相互作用关系，结果表明TRBD结构蛋白和PDI-4蛋I白无直接相互作用；构建pGADT7-gPDI-4重组质粒，和诱饵质粒共转化Y187酵母菌，α-半乳糖苷酶试验检测两种蛋白的相互作用关系，结果表明TRBD结构蛋白和PDI-4蛋白无直接

6、相互作用。利用原核表达的RFC1、真核表达的TRBD蛋白，进行pull-down试验，结果表明TRBD结构蛋白与RFC1蛋白存在相互作用；构建真核表达质粒pEGFP-C1-GcTRBD、pcDNA3.1-HisA-RFC1，共转染293T细胞，Co-IP试验结果表明TRBD结构蛋白与RFC1蛋白在真核细胞内存在相互作用。为下一步研究RFC1蛋白功能及端粒酶相关蛋白的调节机制奠定基础。关键词：犬贾第虫TERT，cDNA文库，互作蛋白，酵母双杂交IIAbstractScreeningandIdentificati

7、onofinteractionproteinofGcTERTTheGiardiahasverysimpleendomembranesystem,onlytheendoplasmicreticulum(ER)andperipheralvesicles(PVs).Itisakindofprimitiveeukaryotesconsideredasamodelorganismandcancauseakindofworldwideparasiticzoonosis.Itiseasytoinfectpeoplebyco

8、nnectingwithpetdogs,policedogandcompanionanimals.Giardiacanis(G.canis)asoneofthemostimportantparasiteforhumanbeingsposesaseriousthreattothehealthofpeople.However,itsmolecularcharacterizationandrelatedr