抗犬贾第虫α-12贾第素单克隆抗体的制备及应用

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1、本项目由国家公益性行业（农业）科研专项（201303042）和国家自然科学基金项目(No.30970322)资助。ThisworkwassupportedbythegrantfromtheSpecialFundforAgro-scientificResearchinthePublicInterestinChina(no.20130304)andfromthetheNationalNaturalScienceFoundationofChina（No.30970322）.I中文摘要抗犬贾第虫α-12贾第素单克隆抗体的

2、制备及应用贾第虫是一种人兽共患寄生原虫，呈世界性分布，主要寄生于鸟类、两栖类及哺乳动物（包括人类）等各种动物，引起被感染对象患有贾第虫病（giardiosis,giardiasis），临床主要特征为腹泻和消化不良。贾第虫病已经被世界卫生组织列为全世界危害人类健康的十大主要的人兽共患寄生虫病之一。贾第虫病不仅给世界各国畜牧业造成严重的危害，而且严重危害了人类的健康。因此，建立快速准确诊断贾第虫病的方法和科学有效防治贾第虫病，已成为需要迫切解决的问题。目前应用于贾第虫病的诊断方法包括病原形态学检查、免疫学检测技术以及

3、分子生物学检测技术。其中，粪样病原检查方法有敏感性低、漏检率高、需要专业人员等缺点；分子生物学检测技术虽然能够快速、敏感的诊断贾第虫病，然而由于需要极专业、昂贵的仪器设备及专业的操作人员，也是成本最高的检测方法之一；免疫学方法检测贾第虫感染的特点是特异性高，操作简便，价格便宜，在贾第虫病的诊断中起着至关重要的作用。其中酶联免疫吸附实验（ELISA）既能检测抗原，也能用于检测抗体，适用于大量样品的检测，双抗夹心ELISA的特异性较普通ELISA更高。目前已有检测人贾第虫病的血清间接ELISA和粪便双抗夹心ELISA

4、试剂盒。但尚无犬相关试剂盒。近年来国内外学者进行了大量关于贾第素的研究。现已证实，在贾第虫的多种骨架蛋白中，包含有α、β、γ和ζ4类贾第素。其中α-贾第素可能是进化过程中膜联蛋白的代表，很可能具有保守的关键结构域而行使相似的功能。尚没有以α-12贾第素为基础的诊断犬贾第虫病的方法。因此建立以α-12贾第素为基础的诊断犬贾第虫病的方法对探讨贾第虫新药靶点、临床诊断治疗方面都具有重要意义。犬是人感染贾第虫的重要传染源，且与人类接触最为密切。因此建立犬贾第虫病的诊断方法十分必要。本试验通过原核表达贾第虫Alpha-12

5、giardin(α-12贾第素)蛋白制备单克隆抗体，建立双抗体夹心ELISA检测方法，旨在为犬贾第虫病诊断和流行病学调查等方面提供I一种快速适用、特异性强的免疫学检测方法。贾第虫α-12贾第素基因的克隆、原核表达及蛋白纯化：以贾第虫总RNA为模板，反转录PCR扩增α-12贾第素基因，将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中，构建重组原核表达载体pET-28a-α-12贾第素，转入大肠埃希菌BL21（DE3）中，应用IPTG诱导表达，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果显示，37℃条件下经

6、1mmol/LIPTG诱导表达5h后，得到分子量（Mr）约为38kDa的包涵体蛋白，与预期大小一致。蛋白质印迹（Westernblot）表明，能够应用小鼠抗贾第虫阳性血清，识别出α-12贾第素重组蛋白，具有较强的免疫原性。将目的蛋白利用超声破碎，并通过Ni-亲和层析柱纯化，经SDS-PAGE分析，在38kDa处可见有单一的一条蛋白带。基于α-12贾第素间接ELISA检测鼠感染犬贾第虫方法的建立：选择α-12贾第素蛋白为检测抗原，以贾第虫阳性小鼠血清为一抗，建立间接ELISA检测鼠感染犬贾第虫方法，确定抗原的最佳包

7、被量为0.25μg/孔，待检血清最佳稀释度为1:800，最佳封闭剂是5%脱脂奶粉，HRP标记二抗的最佳工作浓度为1:5000，试验具有可重复性；试验可检出鼠贾第虫高免血清最大稀释度为1:25600，具有灵敏性；对贾第虫的检测具有特异性，与鼠抗路氏锥虫血清、鼠抗隐孢子虫血清和鼠抗弓形虫血清无交叉反应。本试验方法为后期制备单克隆抗体试验中检测感染后血清中的特异性抗体奠定基础。基于α-12贾第素间接ELISA检测犬感染贾第虫方法的建立：以α-12贾第素蛋白为抗原，以感染贾第虫后的阳性犬血清为一抗，建立间接ELISA检测

8、犬感染贾第虫方法。确定抗原最佳包被浓度为2.0μg/孔，一抗血清的稀释度为1:100，最佳封闭剂为5%脱脂奶粉，HRP-标记二抗的最佳稀释度为1:5000。本试验方法的敏感性较高，血清稀释到1:200时仍可检测到阳性；试验方法具有较高的特异性和可重复性，对65份犬待检血清样品的贾第虫检出率为92.3%。抗α-12贾第素单克隆抗体的制备及纯化：用纯化的重组抗原免疫BALB/