黑柄炭角菌生物学特性与其活性物质的初步研究

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1、●夺‘’捅要本文以产于浙江北部的黑柄炭角菌(杪』a，』a门j弘劫Ps)为实验材料，利用菌种分离、液体深层发酵、PCR、柱层析、纸层析、紫外光谱、高效液相色谱技术和化学反应等手段，对黑柄炭角菌的生物学特性、液体发酵的培养条件以及部分生物活性成分进行了研究，主要内容包括：黑柄炭角菌培养的营养因子以及环境条件的摸索，液体培养基及培养条件的筛选，发酵罐深层发酵曲线的测定，黑柄炭角菌菌索、菌丝及菌核的工TS序列分析、菌丝体多糖的分离纯化及结构的鉴定，黑柄炭角菌菌丝多糖的提取的条件优化，甘露醇的提取及含量分析，发酵菌丝、菌索以及菌核核二肾的含量分析，实验结果如下：1．优化筛选出了黑柄炭角菌

2、最适合的固体培养基和最佳的培养条件。黑柄炭角菌对葡萄糖、果糖的利用效果较好；黄豆粉、花生粉、蚕蛹粉是良好的氮源；柠檬酸对菌丝体生长有促进作用；黑柄炭角菌是一种中温性真菌，在22℃一30℃下均能够生长，但最适合的温度是25℃一26℃；菌丝在pH值为5．0—8．0之问均能够生长，但是以6．O左右为最佳。2．优化筛选出了黑柄炭角菌菌丝体最适液体利-子培养基和最佳培养条件，培养基配方为：土豆20％、蛋白胨5％、蚕蛹粉10％、葡萄糖20％、硫酸镁1％、磷酸二氢钾0．5％、磷酸氢二钾1％、硫酸锌1％、柠檬酸1％。3．测定了黑柄炭角菌菌丝体发酵罐深层发酵的生长曲线，确定发酵刷期以66h为宜，

3、并根据其生长规律，将其分为四个典型生长时划：生长延迟期、生长对数期、生长稳定划及衰老期。4．运』一日PCR扩增技术了黑柄炭角菌菌索、试管培养菌丝、发酵菌丝以及菌核的完整的ITS区(工TSl+5．8S+ITS2)，并通过序列测定，通过对比发现前三者的PCR扩增产物IU泳图谱及整个碱基序列完全一致，可证明本文分离得到的黑柄炭角菌菌株以及发酵菌丝与原始采㈦的菌株为同一菌种。且其与菌核的工TS序列的一致性为87．91％，表明同种不同产地的菌株有较火的差异。5．用正交试验确定了以95℃，加3倍量的水溶液浸泡提取黑柄炭角菌菌丝体5h，为水溶性多糖的最适提耳又力‘法，从每克菌丝体中提珥义的多

4、糖最高可含15．68mg。6．黑柄炭角菌菌丝体经热水浸提、崞析、脱蛋白，得到粗多糖，冉经DEAE一52柱层析纯化得到纯多糖XN—l和xN一2，其中XN—l经葡聚糖G一100柱层析、紫外和荧光光谱检测证明其为单一成分，纸层析表明j￡单糖组分中含有葡萄糖，用高碘酸反应证明其糖基有(1—6)位糖二岢键。7．黑柄炭角菌发酵菌丝体含有丰富的廿露醇，每克干菌粉、菌索和菌核的甘露醇含量分别为57．5mg、53．7mg、65．0mg。8．高效液相色谱技术分析表明，黑柄炭角菌发酵菌丝、菌索及菌核的腺背含量分别为8．79mg／g、2．20mg／g、0．29mg／g；尿苷含量分别为0．32mg／g、

5、2．07mg／g、0．24mg／g。另外还有三种含量相对较高的≥e它核二乩有待进一步的确定。关键词：黑柄炭角菌，生物学特性，活性物质，多糖，核苷●憎．，‘，鸯●AbstractThebiologicalcharactersandsomebioactiVecompoundsofz儿刎a刀』鳓Ps，whichoriginal1yc011ectedfromNorthernZhe．jiangprovincewerestudiedbymeansoftissue1so上atlon，1iauidfermentation，PcR，c01umnchr。matography，TLc，HPLcand

6、sDectrumtechn0109y。ThemaincontentsincludedtheoDtimizationofthenutritiousfactorsandtheenVlr。nmentalconditionsf。ritsgrowth，screeningofits1iquidfermentatloncondition：dete砌inationofthegrowthcurVeofthespawn1ntheDrocessoffermentation：analysisoftheITSsequenceo士rhizomorphandmycelium：is01ution，purifi

7、cationandstructura．Lanalysisofp01ysaccharideextractedfromthemyceJ-1ao士彳订a，ja力j∥如es：extractionanddeterminationo士thewater—solublep01ysaccharide，mannit01andnucleotldes。lneresultshowedasbelow：．1．Theoptimumnutritioussourcesofsolidmedlumandenvironmentalc