花背蟾蜍pax6 variant蛋白的表达及其生物学特性及功能的初步研究

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1、兰州大学硕士学位论文花背蟾蜍Pax6variant蛋白的表达及其生物学特性及功能的初步研究姓名：张蕊申请学位级别：硕士专业：发育生物学指导教师：高岚20100601兰州大学研究生学位论文中文摘要Pax6是眼发育过程中一种重要的转录调控因子，它包括两个DNA结合区域(配对区和同源区)和一个脯氨酸／丝氨酸／苏氨酸(PST)富集区。Pax6基因对脊椎动物眼的结构发育和嗅觉细胞的分化都是必需的。Pax6基因有多种突变体，如人类的Pax6突变可导致多种表型突变，包括无虹膜，Peter’s异常，常染色体显性角膜炎，以及家族性的视网膜中央凹发育异常。目前检测到的人类Pax6基因PST区的突变就有12种

2、，其中10种都为截断突变。本实验以花背蟾蜍鳃血循环期胚胎为材料，用RT-PCR法成功克隆得到了花背蟾蜍Pax6variam基因开放阅读框(OpenReadingFrame，ORF)全序列基因，连接至pMDl8．T克隆载体上后，酶切并克隆至pET-28a表达载体，测序后得到构建正确的原核表达载体。将正确的原核表达载体转入Rosetta(DE3)表达宿主菌中，经过表达条件优化后，得到最佳诱导条件为：诱导温度20℃，IPTG浓度O．5mM。在该条件下大量诱导表达His．Pax6variant融合蛋白，经His亲和层析柱纯化后，得到融合蛋白His．Pax6variant。检测蛋白纯度及浓度后，以

3、该蛋白为抗原，免疫昆明品系小鼠制备多克隆抗血清。并利用酶联免疫吸附实验(Enzyme．LinkedImmunosorbentAssay；ELISA)检测抗血清效价，达到一定浓度后，眼球取血获得小鼠抗花背蟾蜍多克隆抗血清。，利用免疫亲和层析法纯化多克隆抗血清，利用酶联免疫吸附实验检测抗体灵敏性，并用WesternBlot法检测抗体的特异性。实验表明纯化后的抗体具有较高特异性。并用3D．PSSM软件对花背蟾蜍Pax6野生型蛋白和Pax6variant蛋白进行了二级结构预测，结果表明Pax6野生型蛋白和Pax6variant蛋白具有相似的螺旋／折叠结构比。在Pax6野生型蛋白中，含有3％的13

4、．折叠和25％的Q．螺旋结构域，而在Pax6variant蛋白中，则含有5％的13．折叠和20％的Q．螺旋。在PST区Pax6variant蛋白比Pax6野生型蛋白少了两个Q．螺旋元件。Pax6variant截断蛋白可能因此失去其反式激活功能，成为Pax6野生型蛋白的结合竞争物，从而形成显性负效应(dominantnegativeeffect)。以上研究结果为进一步阐明花背蟾蜍Pax6variant基因及其编码的蛋白在花背蟾蜍发育过程中的作用机制奠定了良好基础。关键词：花背蟾蜍Pax6variant；多克隆抗体；免疫亲和层析：二级结构III兰州大学研究生学位论文AbstractPax6i

5、saveryimportanttranscriptionfactorineyedevelopment．ItcontainstwoDNA·bindingdomains(pairedboxandhomeobox)andapraline-serine-threonine(PST)一richtransactivationdomain．Pax6geneisessentialforthestructuraldevelopmentoftheeyeandocularcelldifferentiationinvertebrates．Pax6genehasseveralmutationsthathavebe

6、enfoundinthePax6inpatientswithAniridia，Peter’Sanomaly,autosomaldominantkeratitis，andfamilialfovealdysplasia．TwelvemutationshavebeendetectedinthePSTregionofPax6，tenofthemaretruncationmutations．WemadeUSeofthetadpoleofBuforaddeiStrauchatgillsbloodcirculationstage，theOfF(openreadingframe)regionoftheP

7、ax6variantgenenwasclonedsuccessfullyinRT-PCR．ThePCRproductswereligatedintotheT-endsofthePMD18一Tvectorfollowingstandardprotocols．TheconstructsofPax6variantweredigestedfromPMDl8··TandthenligatedintopET28··avector．Thereco