花背蟾蜍晶状体发育相关pax6 variant新基因生物学特性及功能的初步研究

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1、：：兰煎!查窒亟±堂焦迨塞原创性声明本人郑重声明：本人所呈交的学位论文，是在导师的指导下独立进行研究所取得的成果。学位论文中凡引用他人已经发表或未发表的成果、数据、观点等，均己明确注明出处。除文中已经注明引用的内容外，不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究成果做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：凌垄：日期：j蔺州矢害关于学位论文使用授权的声明本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属兰州大学。本人完全了解兰州大学有关保存、使用学位论文的规定，同意学校保存或向国家有关部

2、门或机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权兰州大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用任何复制手段保存和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为兰州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名：垄迂堡二导师签名：论文作者签名：!鹾岂：导师签名：日期：缈中文摘要Pax6是眼发育过程中最重要的调控基因之一。从果蝇到人类等大量物种的眼发育和晶状体决定过程中都存在Pax6。Pax6可以形成多种蛋白亚型，如Pax6、Pax6APD和Pax6(Sa)等。已有研究表明

3、Pax6调控作用的多样性是由Pax6蛋白不同亚型控制的。本课题通过建立花背蟾蜍晶状体不同发育时期的实验模型，以鳃血循环期的胚胎为材料，采用RACE(RapidAmpliphicationofcDNAEnds)的方法，成功克隆得到花背蟾蜍Pax6variant新基因(Genebank：FJl75151)。将该基因进行生物信息学分析，包括载体片段去除、基因开放可读框COpenReadingFrame，ORF)预测、基因编码蛋白结构域预测、同源性的分析等。与花背蟾蜍Pax6进行比对，发现二者的差异在PST域3’端，相似性为53．1％。PST域结构的改变可能导致反式激活功能

4、的改变。配对盒基元序列和同源异型域这两个主要功能区高度保守性意味着该基因在基础发育过程中的重要作用。通过RT-PCR方法获得花背蟾蜍Pax6和Pax6variant差异部分基因序列，将其克隆到pMD．18T载体上，测序正确后将其克隆至pGEX．4T-3融合表达载体上构建了重组质粒pGEX-Pax6和pGEX．Pax6variant。经测序后正确的重组子转化入Rosetta(DE3)表达宿主菌中，诱导表达GST．Pax6和GST-Pax6variant融合蛋白。经GST亲和柱层析进一步纯化获得了可溶性重组蛋白。以纯化的融合蛋白GST-Pax6和GST-Pax6vari

5、ant分别作为抗原，免疫家兔制备多克隆抗体。利用酶联免疫吸附试验(EuSA)、WesternBlot检测其抗血清的效价、灵敏度和特异性。结果表明，Pax6和Pax6variant血清效价均达到1：100000以上。应用WesternBlot初步验证了转录因子Pax6从鳃血循环期到鳃盖完全封闭期都有表达，而Pax6variant仅在鳃血循环期表达，表明Pax6在花背蟾蜍晶状体发育过程中起了更为重要的作用。Pax6variant蛋白是一种Pax6截短蛋白，PST域3’端的因短缺而失去反式激活功能。其DNA结合域与Pax6蛋白一样，可与Pax6蛋白竞争，从而减弱甚至阻断P

6、ax6蛋白执行功能。所以Pax6variant可能作为正常Pax6蛋白的竞争抑制物，起显性抑制作用。IV^■‘ABSTRACTPax6isoneofmanytranscriptionfactorsduringthedevelopmentoftissuesincludingcentralnervoussystemandendocrine#andsofvertebratesandinvertebrates，whichalsoregulateseyedevelopmentinanimalsrangingfromjellyfishtoDrosophilatohumans．T

7、hereareseveralreportedisoformsofthePax6protein，includingPax6，Pax6APDandPax6(5a)．Previousstudieshaveshownthatdifferentisoformsactivatedifferentsetsofdownstreamtargetsduringdevelopment．WemadeuseofthetadpoleofBuforaddeiStrauchatstage20(gJillsbloodcirculationstage)，andnewgene-一Pax6varian