同源盒基因Pax6及bFGF在晶状体发育中的作用及其与白内障的关系

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1、中山大学博士学位论文同源盒基因Pax-6及bFGF在晶状体发育中的作用及其与白内障的关系姓名：夏朝霞申请学位级别：博士专业：眼科学指导教师：刘奕志2003.4.30固溅鑫基因Pax一6及bFGF在晶状镄发鸯审的难褥及其与壹内骧懿关系孛交蓥萋同源盒基因Pax一6及bFGF在晶状体发育中的作用及其与自内障的关系专照名称：l夔辩学学位申请人：夏朝霞指导教师：刘爽志教授中文摘要叁瘸障是鲞爨蘧黧内黄谴匏致蠢往蔽瘸，鼓然鑫蠹舞手零攘豫联合入王晶体植入术W取得十分理想的效果，但仍存在着手术并发症，增加患者经济和精神负担等问题。因此，研究白内障的病因及发病机理，

2、探索非手术方法预防和治疗白t内簿傻凳鑫蠹漳基磁疆究戆重点漾越。f晶获签～邑疫层是壶菸状缎庭缝藏懿肇凄土皮，是晶状体代谢最活跃的部分。负担着晶状体的生长、发商，分化和损伤修复的功能。对于维持晶状体内环境的稳定和晶状体的透明性具商重要的作用。因此磅宠鑫狻体发弯过程中起决定瞧侮蠲懿薹嚣和嚣子戆正霉表遮及萁与叁肉淹翡关、r系，对进⋯步了解白内障发病机制及后发性白内障的防治均疑有重要的意义。^7主要磷突痰容包攮：一、晶状体连续发育模型的建立j，／(一)研究目的L建立螽凝薅连续发弯模垄，为遴一步磺究菇羧捧发弯i妻稷中起决定瞧佟嗣兹基因和翻予的正常表达提供实验

3、基础。(二)研究方法避撬溅明枣藏合楚锈养；将学甄分笼镯蓁；分弱蘩髓楚强不嗣薤龄懿琴鬣帮出生后不同年龄的小鼠；抽提不同胚龄晶状体泡的总RNA及出生后不同年龄小鼠晶状体的总RNA。(三)磺究结栗溺澡盒基锻Pax《及bFGF疆舄炊落发鸯中的传霜及其与国内蓬的关系枣文蘩鐾得到胚龄9，5天(E9．5d)、E12．5d、E17．5d、薪曳10d、出生20d及成年60{1小鼠晶状体的总RNA。形成了晶状体连续发育的各个阶段。(莲)蘩谂孕鼠可以滤过雌雄鼠含谶膛，检查膏溅瞪栓得知，并可以精确计算胎龄天数。因此可得到不同发育时期的敞麟，为建立遴续的晶体黢肖模型提供了

4、w能。凡二、Paxq5在菇竣蒋发套麓攀鬻辫鬻骜裘遮拣嚣聚突-f、(一)研究融的I在建立了小鼠连续发育模型和小鼠晶状体上皮细胞体外培养的基础上，检测Pax-6茬螽凌终孛熬表运}盘瀛，繇变萁表遮撬箨，捺繁冀搏瑟援裁。(二)研究方法抽提小鼠晶状体发育不同龄段晶状体潋的总RNA；RT-PCR法检测Pax-6在晶获簿发喜嚣不辩除段mRNA拳乎餐表述{舔箨枣鬣螽状髂上疫繁鼹培筹；!《esternblot法及免瘦缎化法检测Pax-6在体外嫱髀的晶状体。丘皮细胞不同阶段的蛋自水平的表达；细胞周期时间测定。(三)繇窕壤罴3，l小鼠晶状体上皮细胞在体外培养的鸯长特性

5、囊膜组织块贴壁培养法～般在接种尉48小时后可以观察到囊膜片上的细胞贴爨并鑫癸生长，霹燹蹇簇主翁壤惹呈六遮嚣溪鬟搀嚣，大枣一黧，黎臆透臻。藤莽～周后，从髓膜长出的绷腮逐渐增多，黜胞透明，淄渐失去六边形，变为不瓣则形或棱形，并有伪足伸出。继续培养鳓胞逐渐融合成片，需及时倦代。细胞经簧戟彳～8浚鑫，生长邃裹逐漆变淫，秀戆爨理囊嚣老纯臻象，缨魏侮援壤太，缀臌轮廓变得更为清晰，细胞浆内出现多个窝泡。3．2RT—PCR滋捻测Pax一6襁晶状体发育的不周阶段mRNA水平的表迭缮鬟虽示嶷夺羲菱謇黎瓣．嚣、E12．繇、E17。5d、IOcl、20d茨60d撵鑫程瘦

6、祷泳道有一与227bp相一致的扩增片段。对比条带强鹰提示Pax一6mRNA表达水平懿正态分布趋搬。3，3Pax-6受荻缝绥露学絷毯Pax一6阳能物质主要定饺子体外培养的LECs的细腻核肉。原代培养细胞、传第l代、传第2代及传第3代的阳性表遮情况不同，靛簿有显著性。H蘑添盒基霹Pax-6及bFGF在磊凝蒋发鸯宰兹露鼹及箕与壹悫簿瀚关系枣变蘩霎3．4Western免疫印逑分析Pax一6在LEes中的臻臼表达水平结蔡显示Pax一6多变淹抗体能够识爰LEes中57KD靛蛋瞧。57KD黪蛋冬在蒙代、传1代和传2代晌LEes中明盛袭达，在传第3代细胞中袭达微

7、弱，在晶状体皮质对照组无表达。3。5漉式缀瞧致捡溺缁照焉鬻结皋流式绷胞仅分鄹稳测G-、G2、S期所占缁抛总数的比例，可以看出细胞分裂旺盛期在传第一代和传第二代，随糟传代的继续，细胞分裂能力下降。与Pax一6豁表达瓣棒辐符合。(西)结论4．1本实验中采用浅培养液组织块培养法，方法简便，稳定W靠，大大提简了细憩遥葬敬戏动率。4．2免液组织化学和免疫印迹的试骏结果表鲷，Pax-6基因凝菸编码的蛋囱可在LEes中被识别。原代及传第一代、第二代LEes明显表达57KD灏白。随着l珏【胞不断传代，葵表达呈现递减凌态，表臻Pax一6主要见于舂丝分裂涎盛憝缀鼹，

8、它在维持LEeS增殖、分纯方面具有重要意义。4．3RT-PCR结果显示猩小鼠连续发商模型E9．5、E12．5、E17．5、10d、20d