苏云金芽孢杆菌brcllp29菌株cyt2b基因的克隆、表达与杀蚊活性测定

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1、福建农林大学硕士学位论文摘要Cyt蛋白是由苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillusthuringiensis．subsp．israelensis，Bti)在芽形成孢阶段产生的6．内毒素组成。本研究根据己报道在NCBI上的cyt2B基因序列，设计特异引物对BtLLP29菌株中总DNA进：fTPCR扩增，得到大小约为1,000bp的类似训2B基因，对该基因进行克隆、表达，确定了菌株中cyt2B基因的存在，以pGEX—KG为表达载体构建cyt2B基因的表达重组质粒，并对其杀蚊活性进行测定，从而试图探索Cyt2B蛋

2、白的生物活性及其在菌株中的生物功能。结果表明，经PCR扩增、克隆、测序，获得序列大小约为1,000bp的基因全序列，序列里包含两个ORF，大小分别为789bp和117bp，其qb789bp编码约为262个氨基酸，与文献#Cyt2B蛋白的氨基酸大小一致。利用NCBI上的Blast在线软件进行比较，发现10个Btcyt2B基因序列以及多个基因组片段，其中与己报道的cyt2Ba7，cyt2Ba8等5个基因全序列(包括原始基因片段)同源性达到98％。因此，判断克隆出来的基因序列为cyt2B基因。经SDS．PAGE验证

3、诱导表达重组菌株，显示该蛋白大小约为30kD，确定该基因编码的蛋白为Cyt2B。取Cyt2B蛋白表达重组菌株对白蚊伊蚊和致倦库蚊进行毒性测试，与BtLLP29菌株相比，该表达菌株并不显示杀蚊活性。关键词：苏云金芽孢杆菌，Cyt2B蛋白，克隆，表达，杀蚊活性福建农林大学硕十学位论文Cloning，expressionandidentificationthemosquitocidalofthecyt2BgeneinBacillusthuringiensisLLP29AbstractCyttoxinisproduc

4、edbyBacillusthuringiensis．subsp．israelensis(Bti)duringsporulation．Basedonthecyt2BsequencereportedintheNCBI，thisstudyconstructedtwodegeneratedprimers．UsingtheseprimersandthetotalDNAoftheBtLLP29asatemplate，a1,082bpDNAfragmentwasamplifiedbypolymerasechainreact

5、ion(PCR)andclonedintoEcoilJM109．Aftersequencing，thecyt2BproteinWasproducedinEcoilBL21usingpGEX-KGasexpressionvector．Thenucleotidesequenceshowedtwoopenreadingframes(ORF)inthecyt2Bfragment．Onewas789bplong，encodingaproteinof262aminoacide．Itisverysimilarinsizet

6、othereportedCyt2Bprotein．Thehomologysearchofthecloninggenedisplayedthatithad98％similarto5reportedgeneswhichwerereportedascyt2Ba7orcyt2Ba8．SDS—PAGEanalysisindicatedthattheCyt2Bproteinhadamolecularmassofabout30kD，similartothereportedCyt2Baproteinwhichwasprevi

7、ouslybeenshowntoxictomosquitos．ToxicityactivitiesoftherecombinantstrainsweretestedonAedesalbopictusandCulexpipiens#tiga,',s．ComparedwiththewildBtLLP29strain，therecombinantstraindidn’tshowanytoxicingagainstthem．Keywords：Bacillusthuringiensis，Cyt2，cloning，exp

8、ression，mosquitociden福建农林大学硕J：学位论文引言在上个世纪，化学杀虫剂由于对害虫毒性强、见效快，广泛应用于农、林各方面害虫的治理。其大面积的使用，不只是严重污染了环境，而且也导致了昆虫抗药性产生的问题。虽然科学家采取了交叉使用等多种方法，希望以此缓和抗性产生的问题。这在短期内具有一定的效果，却并不利于其长期发展。因此，研究者一直致力于努力寻找新的杀虫剂来取代化学杀虫剂。生物农