苏云金芽孢杆菌与蜡状芽孢杆菌亲缘关系研究论文

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1、苏云金芽孢杆菌与蜡状芽孢杆菌亲缘关系研究论文【摘要】目的探讨苏云金芽孢杆菌（Bt)与蜡状芽孢杆菌（Bc）的亲缘关系,为Bt鉴定、安全性评价及降低其致病风险等提供科学依据。方法采用肠杆菌基因间重复一致序列-PCR（ERIC-PCR）技术，对6株苏云金芽孢杆菌和3株蜡状芽孢杆菌及对照菌株的基因组DNA进行扩增，对其指纹图谱进行分析；回收并克隆重复性好的苏云金芽孢杆菌基因组DNA扩增片段，以其为探针，分别与供试菌株基因组DNA进行杂交。结果与蜡状芽孢杆菌相比，苏云金芽孢杆菌菌株间基因组DNA指纹图谱较一致；所有供试苏云金芽孢杆菌菌株均扩增产生一条250bp左右的片段；苏云金芽孢杆菌与蜡状芽

2、孢杆菌均可扩增产生600bp左右的共有DNA片段。此外，以苏云金芽孢杆菌500bp片段为探针与苏云金芽孢杆菌基因组DNA杂交有很好的特异性。结论肠杆菌基因间重复一致序列-PCR指纹图谱可以正确反映苏云金芽孢杆菌与蜡状芽孢杆菌亲缘关系；500bp片段可以作为苏云金芽孢杆菌鉴定探针。【关键词】苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)与蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus,Bc)同属于蜡状芽孢杆菌菌群，为自然界中广泛分布的革兰阳性菌〔1〕。其中Bt在其休眠期可形成对昆虫有毒性的伴胞晶体。因此.freelerⅠ：5′-ATGTAAGCTCCTGG

3、GGATTCAC-3′，PrimerⅡ：5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′；（2）试剂：Ex-Taq酶、IPTG、X-gal（大连TaKaRa生物工程有限公司）；pGEM－Tvector连接转化试剂盒（pGEM-TvectorSystemⅡ）及JM109高效率感受态细胞（美国Promega公司）；放射性同位素〔α-32P〕-dCTP和随机引物DNA标记试剂盒（RandomPrimerDNALabelingSystem，英国Biolabs公司）；尼龙膜及3MM滤纸（英国-T载体，转入JM109感受态大肠埃希菌。连接反应、转化操作以及克隆子的鉴定按照常规方法进行；阳

4、性克隆子用NaOH/SDS碱裂解法制备质粒DNA。124斑点杂交按照随机引物DNA标记试剂盒（RandomPrimerDNALabelingSystem）说明标记回收产物，以标记产物为探针，分别与供试菌株基因组DNA进行杂交。125引物设计及PCR验证发生特异性杂交反应的克隆片段由大连TaKaRa生物工程有限公司进行测序。利用PrimerPremier50软件〔8〕,根据特异克隆片段序列信息设计引物，序列分别为:BthⅠ：5′CGAGCAGTAGGCGAACCATTG-3′BthⅡ:5′TGGCATGGGCTTTCGGATATT-3′。引物对应的扩增产物长度为363bp

5、；PCR反应条件：94℃预变性2min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，共30循环；72℃延伸5min。体系同ERICPCR。以6株Bt及其他对照菌株的染色体DNA作为模板，进行PCR反应。2结果21ERIC-PCR图谱（图1）6株苏云金芽孢杆菌和3株腊状芽孢杆菌的基因组DNA经ERIC-PCR扩增，均可产生清晰的DNA指纹图谱，扩增片段范围100～2500bp，各菌株扩增图谱的多态性程度不同。Bt基因组DNA指纹图谱较一致，由3条主带构成，所有供试Bt菌株均有1条250bp左右的扩增片段，而蜡状芽孢杆菌间DNA指纹图谱变异较大。另外，Bt和Bc均可扩增得到600bp左

6、右的共有片段。1：CGMCC11749；2：CGMCC11754；3：CGMCC12944：CGMCC1905；5：CGMCC1989；6：CGMCC118467：CGMCC1126；8,9：Bc分离株B：negativecontrol-noDNAM：DL2000图1Bt、Bc基因组DNAERIC－PCR结果指纹图谱（略）22斑点杂交（图2）纯化、克隆指纹图谱中稳定出现的BtDNA扩增片段，经DU-640测定浓度约为90μg/L，以其为探针对固定于膜上的供试菌株基因组DNA进行斑点杂交。结果显示，以500bp片段为探针，与苏云金芽孢杆菌杂交结果为阳性，枯草芽孢杆菌及属

7、外的各菌株杂交结果为阴性。23PCR验证（图3）根据特异克隆片段序列设计的BthⅠ和BthⅡ引物对，可以从Bt菌的基因组DNA中扩增出约360bp的片段，符合预期结果；而所有对照菌株均没有扩增条带，表明此特异片段来源于Bt菌基因组DNA。1～6：Bt菌株；7,8,9：Bc菌株；10：枯草芽孢杆菌；11：大肠埃希菌；12：金黄色葡萄球菌图2500bp探针对各菌株杂交放射性自显影15d照片（略）1～6：Bt菌株；7,.freelicsofthebacill