苏云金芽孢杆菌与蜡状芽孢杆菌亲缘关系研究

《苏云金芽孢杆菌与蜡状芽孢杆菌亲缘关系研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、苏云金芽孢杆菌与蜡状芽孢杆菌亲缘关系研究【摘要】目的探讨苏云金芽孢杆菌（Bt)与蜡状芽孢杆菌（Bc）的亲缘关系,为Bt鉴定、安全性评价及降低其致病风险等提供科学依据。方法采用肠杆菌基因间重复一致序列-PCR（ERIC-PCR）技术，对6株苏云金芽孢杆菌和3株蜡状芽孢杆菌及对照菌株的基因组DNA进行扩增，对其指纹图谱进行分析；回收并克隆重复性好的苏云金芽孢杆菌基因组DNA扩增片段，以其为探针，分别与供试菌株基因组DNA进行杂交。结果与蜡状芽孢杆菌相比，苏云金芽孢杆菌菌株间基因组DNA指纹图谱较一致；所有供试苏云金芽孢杆菌菌株均扩增产生一条250bp左右的片段；苏云金芽孢杆菌与蜡状芽孢杆菌

2、均可扩增产生600bp左右的共有DNA片段。此外，以苏云金芽孢杆菌500bp片段为探针与苏云金芽孢杆菌基因组DNA杂交有很好的特异性。结论肠杆菌基因间重复一致序列-PCR指纹图谱可以正确反映苏云金芽孢杆菌与蜡状芽孢杆菌亲缘关系；500bp片段可以作为苏云金芽孢杆菌鉴定探针。【关键词】苏云金芽孢杆菌　　苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)与蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus,Bc)同属于蜡状芽孢杆菌菌群，为自然界中广泛分布的革兰阳性菌〔1〕。其中Bt在其休眠期可形成对昆虫有毒性的伴胞晶体。因此，被作为生物杀虫剂广泛应用于农业及卫生害虫的生物防治；Bc

3、则是人畜条件致病菌，可导致人食物中毒和感染，引起呕吐和腹泻〔2〕。研究表明，在自然环境中，两者染色体体外遗传物质可以出现高度重组〔3〕，在DNA水平也具有较高的同源性，只有个别碱基有差异〔4〕。由于Bt与Bc的相似性，许多细菌分类学家认为Bt与Bc应为同一个种〔5〕。Bt和Bc间的同源性关系，使Bt安全性问题越来越受到人们重视。因此，为研究两者的亲缘关系，对Bt的鉴定、Bt应用的安全性评价，以及进一步提高Bt杀虫效力、降低其致病风险，本文利用肠杆菌基因间重复一致序列（ERIC）－PCR技术〔6〕对Bt和Bc全基因组DNA进行扩增，对获得的Bt和Bc基因组DNA指纹图谱进行分析，探讨Bt

4、和Bc起源进化关系，同时筛选并克隆了Bt基因组DNA扩增片段，对应用ERIC-PCR技术鉴别、鉴定Bt和Bc进行可行性探讨。结果报告如下。　　1材料与方法　　11材料　　111菌株Bt6株（菌株号为CGMCC11749、CGMCC11754、CGMCC1294、CGMCC1905、CGMCC1989、CGMCC11014），Bc标准株1株（菌株号为CGMCC1126），大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等对照菌株各1株（菌株号分别为CGMCC190、CGMCC1933和CGMCC189）〔购于中国普通微生物菌种保藏中心（CGMCC)〕，Bc分离株2株为沈

5、阳出入境检验检疫局分离,并经国标生化鉴定。　　112PCR引物及试剂(1)ERIC引物:由大连TaKaRa生物工程有限公司合成，引物序列分别为：PrimerⅠ：5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′，PrimerⅡ：5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′；（2）试剂：Ex-Taq酶、IPTG、X-gal（大连TaKaRa生物工程有限公司）；pGEM－Tvector连接转化试剂盒（pGEM-TvectorSystemⅡ）及JM109高效率感受态细胞（美国Promega公司）；放射性同位素〔α-32P〕-dCTP和随机引物DNA标记试剂盒（Rando

6、mPrimerDNALabelingSystem，英国Biolabs公司）；尼龙膜及3MM滤纸（英国-T载体，转入JM109感受态大肠埃希菌。连接反应、转化操作以及克隆子的鉴定按照常规方法进行；阳性克隆子用NaOH/SDS碱裂解法制备质粒DNA。　　124斑点杂交按照随机引物DNA标记试剂盒（RandomPrimerDNALabelingSystem）说明标记回收产物，以标记产物为探针，分别与供试菌株基因组DNA进行杂交。　　125引物设计及PCR验证发生特异性杂交反应的克隆片段由大连TaKaRa生物工程有限公司进行测序。利用PrimerPremier50软件〔8〕,根据特异

7、克隆片段序列信息设计引物，序列分别为:BthⅠ：5′CGAGCAGTAGGCGAACCATTG-3′BthⅡ:5′TGGCATGGGCTTTCGGATATT-3′。引物对应的扩增产物长度为363bp；PCR反应条件：94℃预变性2min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，共30循环；72℃延伸5min。体系同ERICPCR。以6株Bt及其他对照菌株的染色体DNA作为模板，进行PCR反应。　　2结果　　21ERIC-PCR图谱（图