苏云金芽孢杆菌BRCLLP29菌株cyt2基因的克隆、表达及杀蚊活性测定

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1、福建农林大学硕士学位论文摘要Cyt蛋白是由苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillusthuringiensis.subsp.israelensis，Bti)在芽形成孢阶段产生的δ-内毒素组成。本研究根据己报道在NCBI上的cyt2B基因序列，设计特异引物对BtLLP29菌株中总DNA进行PCR扩增，得到大小约为1,000bp的类似cyt2B基因，对该基因进行克隆、表达，确定了菌株中cyt2B基因的存在，以pGEX-KG为表达载体构建cyt2B基因的表达重组质粒，并对其杀蚊活性进行测定，从而试图探索Cyt2B蛋白的生物活性

2、及其在菌株中的生物功能。结果表明，经PCR扩增、克隆、测序，获得序列大小约为1,000bp的基因全序列，序列里包含两个ORF，大小分别为789bp和117bp，其中789bp编码约为262个氨基酸，与文献中Cyt2B蛋白的氨基酸大小一致。利用NCBI上的Blast在线软件进行比较，发现10个Btcyt2B基因序列以及多个基因组片段，其中与己报道的cyt2Ba7，cyt2Ba8等5个基因全序列（包括原始基因片段）同源性达到98%。因此，判断克隆出来的基因序列为cyt2B基因。经SDS-PAGE验证诱导表达重组菌株，显示该蛋

3、白大小约为30kD，确定该基因编码的蛋白为Cyt2B。取Cyt2B蛋白表达重组菌株对白蚊伊蚊和致倦库蚊进行毒性测试，与BtLLP29菌株相比，该表达菌株并不显示杀蚊活性。关键词：苏云金芽孢杆菌，Cyt2B蛋白，克隆，表达，杀蚊活性I福建农林大学硕士学位论文Cloning,expressionandidentificationthemosquitocidalofthecyt2BgeneinBacillusthuringiensisLLP29AbstractCyttoxinisproducedbyBacillusthurin

4、giensis.subsp.israelensis(Bti)duringsporulation.Basedonthecyt2BsequencereportedintheNCBI,thisstudyconstructedtwodegeneratedprimers.UsingtheseprimersandthetotalDNAoftheBtLLP29asatemplate,a1,082bpDNAfragmentwasamplifiedbypolymerasechainreaction(PCR)andclonedintoE.c

5、oilJM109.Aftersequencing,thecyt2BproteinwasproducedinE.coilBL21usingpGEX-KGasexpressionvector.Thenucleotidesequenceshowedtwoopenreadingframes(ORF)inthecyt2Bfragment.Onewas789bplong,encodingaproteinof262aminoacide.ItisverysimilarinsizetothereportedCyt2Bprotein.The

6、homologysearchofthecloninggenedisplayedthatithad98%similarto5reportedgeneswhichwerereportedascyt2Ba7orcyt2Ba8.SDS-PAGEanalysisindicatedthattheCyt2Bproteinhadamolecularmassofabout30kD,similartothereportedCyt2Baproteinwhichwaspreviouslybeenshowntoxictomosquitos.Tox

7、icityactivitiesoftherecombinantstrainsweretestedonAedesalbopictusandCulexpipiensfatigans.ComparedwiththewildBtLLP29strain,therecombinantstraindidn’tshowanytoxicingagainstthem.Keywords:Bacillusthuringiensis,Cyt2,cloning,expression,mosquitocideII独创性声明本人声明，所呈交的学位（毕业

8、）论文，是本人在指导教师的指导下独立完成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。学位（毕业）论文作者亲笔签名