人整合素分子α4β7的克隆与表达

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1、英文缩写词表Amp：bp：BSA：CH0：CLA：DEPC：DHFR：Dig：EC：Ep：ELISA：FACS：GAlJ：GST：GVHD：HRP：IPTG：LP：MAb：MAdCAM—lM吐N：ne0：PaB：PAGE：PBPC：(按英文字母排序)氨苄青霉索碱基对牛血清白蛋白中国仓鼠卵巢癌细胞皮肤淋巴细胞相关抗原焦碳酸二乙酯二氢叶酸还原酶地高辛内皮细胞Eppendorf离心管酶连免疫吸附试验荧光激活细胞分类术肠相关淋巴组织谷胱甘肽巯基转移酶移植物抗宿主反应辣根过氧化物酶异丙基．B—D一半乳糖苷肠道固有层单克隆抗

2、体细胞粘膜定居素一1肠系膜淋巴结新霉素多克隆抗体聚丙烯酰胺凝胶电泳外周血前体细胞英文缩写词表PBS：PCR：PLN：PNAd：PP：RNaseA：Rnasin：rpm：RT：SDS：SⅣ口一PCRTEM匣D：VCAIVl—l：磷酸盐缓冲液多聚酶链反应外周淋巴结外周淋巴结定居素派伊尔结RNA酶ARNA酶抑制剂每分钟转数反转录十二烷基磺酸钠单突变引物PCR四甲基乙二氨血管粘附分子一1中文摘要摘要

3、。，f整合素是粘附分子的一个家族，是由a和p亚基通过非共价连接而形成的异二聚体。它们在细胞之间以及细胞与基质间的粘附中起关

4、键作用，并参与免疫应答、细胞移行、肿瘤转移等一系列的生理和病理过程。至今已发现16种a亚基和9种D亚基，以及由它们组成的至少24种整合素分子。其中I扫ct4亚基参与形成的整合素有oc4137年lJa4131两种。人整合素的a4和07亚基分别由999和779个氨基酸残基组成，糖基化后二者的分子量分别为150KD和110KD。cc4137的主要功能是通过与其配体一细胞粘膜定居素(MAdCAM．1·mucosaladdressincelladhesionmolecule．1)的相互作用，介导淋巴细胞向派伊尔结(PP)、

5、肠道固有层(LP)等肠相关淋巴组织(GALT)的归巢。并在慢性结肠炎、轮状病毒感染引起的肠道炎症以及其它肠道疾病中发挥重要作用。另～种旺4整合素c1413I，参与多种病理过程，抗Ⅸ4的mAbs可有效缓解变态反应性哮喘、变应性皮炎和移植物抗宿主反应(GVHD)等多种疾病。因此，获得抗(z4和B7的抗体，建立稳定表达a4137的细胞系，对进行粘膜免疫以及相关疾病发病机理的研究都具有重要意义。卜～本研究将B7的l8kbcDNA片段亚克隆入原核融合表达载体pGEX一3X，构建成3X—l8[37重组表达质粒，经[PTG诱导

6、，重组蛋白在Ecoli中得到了高效表达。表达产物以包含体形式存在。免疫印迹实验表明：抗D7的标准单抗Fib504能识别融合蛋白。以纯化的中文摘要————————————————————一—————————————————————————————一融合蛋白为免疫原制备了多抗，ELISA检测抗体效价为1：102400。从HL．60细胞系中提取总RNA，根据文献报道的人整合素分子Ⅸ4亚基的cDNA序列，用RT—PCR分两段(O8kb，1．2kb)扩增了d4不带信号肽的20kbcDNA片段，序列分沂发现在第一段中存在一处

7、错义突变，经不同克隆间的拼接去除该突变后，将两片段连接在一起，并将其中的l7kbcDNA亚克隆入原核融合表达载体pGEX—KG，构建成重组表达质粒KG一17a4。经IPTG诱导，Ⅸ4片段在大肠杆菌中获得了高效表达，表达产物以包含体形式存在，以纯化的融合蛋白为免疫原制备了多抗，经ELISA检测，抗体效价为l：51200。f根据文献报道的序列，用RT—PCR分三段(o94kb，l2kb，o96kb)扩增f(i43lkb的全长cDNA序列，序列分析发现在第一段中存在～处移码突变，经单突变引物PCR(SMP—PCR)和不

8、同克隆间的拼接去除突变后，将三片段连接在一起，构建成重组质粒M13一吼4。与文献报道序列相比，所获得的cDNA存在五处同义突变(40、67、186l、2725和2899位)，一处错义突变f2650位)。经GOLDKAY分析，错义突变对刚的抗原性无影响。将ct4和B7的全长cDNA分别克隆入真核表达载体pcDNA31和pCI．dhfr，构建成重组表达质粒31．ct4和pCI—D7。然后将31一吼4单独转染，或31一Ⅸ4和pCI—f／7共转染CHO(dhfr，)细胞系。经G418和氨甲蝶呤(MTx)加压筛选，以及RT

9、．PCR、狭缝杂交和FACS检测，获得了多株表达0【4或cc487的阳性克隆。r～关键词：整合素cc4137RT—PCRcDNA克隆表达纯化一茎塑AbstractIntegrinsareafamilyofadhesionmolecules，andareheterodimericmoleculesmadeupofnoncovalentlyassociatedⅨandDsub