钙整合素结合蛋白cib的原核表达及多克隆抗体的制备与亚细胞定位

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1、钙整合素结合蛋白CIB的原核表达及多克隆抗体的制备与亚细胞定位石洁,惠玲*,张煦,王晓辉,杨金升,吕同德,赵治华,哈小琴【摘要】　　目的:构建钙整合素结合蛋白(calciumandintegrinbindingprotein,CIB)的原核表达载体,制备小鼠抗人CIB的多克隆抗体并探讨其亚细胞定位。方法:采用RTPCR方法从人脑组织扩增CIB的cDNA片段,利用DNA重组技术构建原核表达载体pET32aCIB,转入BL21(DE3)中,以IPTG诱导BL21(DE3)表达CIB融合蛋白,SDSPAGE鉴定

2、融合蛋白CIB的表达。用含CIB融合蛋白的聚丙烯酰胺凝胶颗粒为抗原免疫小鼠制备抗血清,抗血清分别经ProteinG、抗原亲和层析后用:ToconstructtheprokaryoticexpressionvectorpET32aCIB,preparethespecificpolyclonalantibodyagainstCIBandstudythesubcellularlocalizationofCIB.METHODS:CIBplifiedbyRTPCRfromhumanbraintissueandcloned

3、intoprokaryoticexpressionvectorpET32aCIB.TheCIBfusionproteinandidentifiedbySDSPAGE.ThemicemunizedidegelparticlescontainingtheCIBfusionproteinforpolyclonalantibodypreparation.Theantibodyatographiccolumnmatrixcoupledmunohistochemistry.RESULTS:TheproteinofCIBmu

4、nizingBALB/cmiceidegelparticlescontainingthefusionproteinofCIBandpurification.TheresultsofimmunohistochemistrydemonstratedthatCIBinantlyinthecytoplasmofSHG44andHhu7cells.CONCLUSION:TheproteinofCIBhasbeenclonedandexpressedsuccessfully.Thespecificpolyclonalantib

5、odyagainsttheproteinofCIBhasbeenobtained,andintegrinbindingprotein,CIB)是1998年研究人员用integrinaIIbsubunit为诱饵通过酵母双杂交得到的一个新基因,对该蛋白的序列结构分析表明,它含有4个EFhand结构域,其中EFhand3、4位于C端,与钙离子有很高的亲和性〔1〕。它的许多特性与另一含有EFhand结构域的恢复蛋白家族的神经钙感受器蛋白(NSC)相似〔2〕。与NSC蛋白不同的是CIB不只在神经元表达,它在机体的许

6、多组织如脑、心脏、肺等均有表达。CIB也是3个重要的钙结合蛋白之一,与其他2个已知的参与多种蛋白调节的钙结合蛋白钙调磷酸酶B(calcineurinB,CnB)及钙调素(calmodulin,CaM)有很高的同源性,研究表明CIB也与这个两钙调蛋白一样,是一种钙离子感受器,它与钙离子结合后会引起CIB蛋白构象的改变,使它能与其他的蛋白因子结合,从而影响细胞的功能。表达并制备其抗体对于基因的功能研究将起重要作用,如免疫组化、蛋白质相互作用的鉴定等许多方面工作的开展都需要有特异的抗体作为辅助。因此,我们构建了CIB的原

7、核表达载体,进行了原核表达和纯化,并免疫小鼠获得抗体,为进一步研究CIB的功能提供参考。　　1材料和方法　　1.1材料限制性内切酶、T4DNA连接酶、各种工具酶均购自TaKaRa公司,TaqPlusIDNA聚合酶、dNTPs、引物购自上海生工生物公司,DMEM培养基购自Gibco公司,胎牛血清为杭州四季青公司产品,异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)、弗氏佐剂均为Sigma公司产品,辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG、TITC标记的羊抗鼠IgG为北京中杉公司产品;大肠杆菌BL21(DE3)和pET32

8、质粒（NOVAGEN）购自北京天为时代;BALB/c小鼠（雌性,体质量18～22g）由兰州军区兰州总医院医学实验动物科提供;SHG44胶质瘤细胞株、Huh7肝癌细胞株由兰州军区兰州总医院医学实验中心惠玲博士提供。　　1.2方法　　1.2.1人脑组织总RNA的提取及逆转录RNA的提取按Gibco公司的TRIzol试剂所提供的方法进行,电泳检测RNA有无降解。在