游离脂肪酸对胰岛微血管内皮细胞的脂毒性与非诺贝特的保护作用

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1、硕士学位论文游离脂肪酸对胰岛微血管内皮细胞的脂毒性及非诺贝特的保护作用硕士研究生：谢芳英指导老师：蔡德鸿摘要生理水平的游离脂肪酸(freefattyacids，FFAs)在机体内起着重要的生理作用，不但为组织器官提供能量，而且是胰岛13细胞释放胰岛素所必需。然而，血游离脂肪酸水平长期升高时，肝脏、骨骼肌、脂肪组织等不能将FFA氧化和转化为甘油三酯，使FFA沉积于非脂肪组织而对组织和细胞的功能和代谢造成损害，又称为游离脂肪酸的脂毒性。研究表明，胰岛素抵抗患者、肥胖症和2型糖尿病患者往往存在空腹和餐后高游离脂

2、肪酸血症。近年来，血浆游离脂肪酸升高对细胞的脂毒性，成为糖尿病病理生理机制研究的热点之一。研究发现，代谢综合征患者血管组织长期暴露于高FFA环境中，血管形态和功能可受到明显损害。综上所述，采用适当的措施干预胰岛素抵抗患者FFA诱导的损伤是非常必要的。胰岛是高度血管化的微器官，其毛细血管网的密度大约是胰腺外分泌组织的5倍。胰岛微血管负责为胰岛提供血供，参与胰岛内分泌功能，在胰岛生理过程中起着重要的作用，因此维持微血管内皮细胞的形态和功能的完整性对于维持胰岛功能至关重要。许许多多的研究已经阐述了代谢综合症患者

3、血浆中FFA对胰岛p细胞的损伤及其发生机制，然而胰岛的微血管内皮细胞(isletmicrovascularendothelialcells，IMEC)作为直接接触血浆的屏障，长期暴露于升高的FFA，可产生如何影响，目前未见报道。本研究采用含有软脂酸的培养液与胰岛内皮细胞株MS．1共孵育，模拟血浆游离脂肪酸的作用，评估游离脂肪酸中文摘要对胰岛内皮细胞增殖率和凋亡的影响，探讨胰岛素抵抗及糖尿病患者胰岛微血管损害的可能机制。氯贝丁酸类药包括非诺贝特、吉非贝特、氯贝丁酯，是过氧化物酶体增殖物激活受体一OL(per

4、oxisomeproliferators—activatedreceptor-or，PPAROL)的人工合成配体，作为调脂药物已经在临床上使用了三十余年。研究已经证实氯贝丁酸类药物可以调节众多基因的转录，包括线粒体脂质过氧化物酶体和微粒体中与脂肪酸氧化有关的基因，对于脂肪酸的生物氧化、脂肪贮存均具有关键的作用。近年的研究表明氯贝丁酸类药物还具有有益的非调脂作用，例如抗氧化应激、抗炎、抗肿瘤细胞增殖、抗微血管病变、保护微血管内皮等作用。2005年和2007年报导的大型FIELD(FenofibrateInt

5、erventionandEventLoweringinDiabetes)l临床研究证实，2型糖尿病患者长期使用非诺贝特治疗可显著减少糖尿病患者微血管事件，可以显著延缓糖尿病患者已有视网膜微血管病变的进一步发展，证实非诺贝特对微血管的保护作用。实验研究证实非诺贝特可通过多种机制对肾小球内皮细胞起保护作用。本研究采用非诺贝特进行干预，初步探讨游离脂肪酸损伤IMEC的机制以及非诺贝特的保护作用，为临床干预游离脂肪酸介导的胰岛微血管损伤提供实验依据。第一章游离脂肪酸诱导胰岛微血管内皮细胞凋亡的研究研究目的：观察软

6、脂酸对胰岛微血管内皮细胞株MS．1增殖率、凋亡率的影响。研究方法：1．细胞培养：MS一1细胞使用含10％新生牛血清的DMEM培养基，置于37"C，5％C02培养箱中培养，2—3d换一次液，4．5d传代一次。2．软脂酸DMEM培养液制备：软脂酸溶于无水酒精，置于通风橱中过夜干燥。加入相当分子量的NaOH溶液，加热溶解，制成皂化液。使用前加热溶解，II硕士学位论文加入含1％BSA的DMEM完全培养基中，磁力搅拌器搅拌4h，制备成含有1．0mmol／L软脂酸的DMEM工作液。3．试验分组：研究设置对照组和软脂酸

7、试验组，分别用含I％BSA的DMEM培养基和含有0．5mmol／L、1．0mmol／L软脂酸和I％BSA的DMEM培养液培养。4．MTT细胞增殖率试验：处于对数生长期的MS．1细胞制备成最终浓度为1x105／mL的细胞一DMEM悬液接种于96孔板。与含有不同软脂酸的DMEM工作液，培养12小时，加入20I．tLMTT(5mg／mL)，避光37。C，5％C02孵育4小时，加入DMSO，震荡混匀后于酶标仪上测定490nm的OD值。计算细胞增殖率：细胞增殖率=样本OD／对照组OD均数x100％。5．荧光显微镜检

8、测凋亡细胞将软脂酸孵育后的细胞行AnnexinV-FITC／PI双染色，荧光显微镜下观察细胞凋亡情况。6．流式细胞仪检测凋亡细胞：对照组和实验组的细胞用胰酶消化后，经．AnnexinVFITCF／PI双染色后用流式细胞仪检测凋亡细胞。7．数据处理：数据以i士sD表示，采用SPSS13．0分析，所有各组所得数据经正态分布检验符合正态分布后行相应分析，单因素设计资料数据采用one—wayANOVA分析组间差异显著性，析因设计资料的