二甲双胍对胰岛细胞脂毒性的保护作用

《二甲双胍对胰岛细胞脂毒性的保护作用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、二甲双胍对胰岛细胞脂毒性的保护作用：王玉环，达婷，阎丽丽，郑华东，吴娟娟，张静【摘要】目的探讨二甲双胍(MF)在游离脂肪酸(FFA)诱导的胰岛细胞凋亡中的作用及机制。方法采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法观察FFA对小鼠βTc3细胞增殖的抑制作用;流式细胞术检测细胞的凋亡率;免疫细胞化学和F作用下的表达。结果FFA对体外生长的βTc3细胞具有明显的抑制作用，并可诱导细胞凋亡;MF可显著减少这一过程中的细胞凋亡。细胞免疫化学及F没有能够抑制FFA引起的pJNK活化。结论MF可以抑制FFA介导的小鼠βTc3细胞凋亡，但不是通过JNK信号转导通路发

2、挥作用的。【关键词】游离脂肪酸;βTc3细胞;JNK信号通路;二甲双胍;脂性凋亡　ABSTRACT:ObjectiveToinvestigatetheeffectsofmetforminonapoptosisinmouseβTc3cellsinducedbyfreefattyacids(FFA)andtheunderlyingmechanism.MethodsMTTassayetry.TheexpressionsofpJNKandpcjunmunocytochemistryandetformincouldinhibittheapoptos

3、isofmouseβTc3cellsstimulatedbyfreefattyacids,buttheJNKsignalingpathechanism.　　KEYF)。近年来研究指出，在2型糖尿病中MF改善胰岛素敏感性与循环中FFA降低相关[34]，它可改善脂毒性对胰岛细胞的损害[5]。有报道表明，JNK信号通路参与了β细胞凋亡、胰岛素基因表达障碍和胰岛素抵抗的发生[6]。JNK抑制剂的应用可显著减少FFA介导的胰岛β细胞凋亡[7]。在本研究中，我们通过FFA诱导胰岛β细胞凋亡，观察MF干预下胰岛β细胞凋亡率及JNK活性的变化，初步探讨MF对

4、高FFA环境下的胰岛β细胞有无保护作用及其作用机制。　　1材料与方法　　1.1材料小鼠βTc3细胞由唐都医院内分泌科实验室馈赠;棕榈酸(PA)、特异性JNK抑制剂SP600125及实验用MF均购自Sigma公司;RPMI1640培养基为GIBCO公司产品。胎牛血清为Hyclone公司产品;AnnexinVFITC细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司;鼠抗磷酸化JNK(pJNK)、磷酸化cjun(pcjun)、βactin抗体为SantaCruz公司产品;二抗SP免疫组化染色试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司;二抗HR

5、P标记的山羊抗小鼠IgG、DAB显色试剂盒均购自北京中衫金桥生物技术有限公司;RIPA细胞裂解液购自北京索莱宝生物科技有限公司;BCA蛋白分析试剂盒及ECL试剂盒购自美国Pierce公司;丙烯酰胺、双丙烯酰胺、Tris、TEMED、十二烷基磺酸钠(SDS)、过硫酸铵(APS)、甘油、溴酚兰、甘氨酸、二硫苏糖醇(DTT)等均为Amresco产品;硝酸纤维素(NC)膜为Amersham公司产品。　　1.2方法　　1.2.1细胞培养小鼠βTc3细胞用含100mL/L胎牛血清的RPMI1640完全培养基(青霉素100u/mL、链霉素100μg/mL)，

6、在饱和湿度、37℃、50mL/LCO2孵箱中培养传代。细胞每两天换液1次，4～5d以2.5g/L的胰蛋白酶消化传代1次。　　1.2.2实验分组与处理选择生长良好的细胞用于实验。实验分4组，A组(对照组);B组(PA组)：0.5mmol/L的PA干预;C组(PA+SP600125组)：SP600125(20μmol/L)预先孵育1h，再以0.5mmol/L的PA干预;D组(PA+MF组)：MF(0.5mmol/L)及0.5mmol/L的PA共同孵育。　　1.2.3MTT法检测细胞增殖活力取对数生长期细胞制成单细胞悬液，接种于96孔细胞培养板上，每

7、孔200μL培养液。按上述分组处理细胞后，分别于12、24、48h取出，每孔加入20μL(5g/L)MTT，继续培养4h，弃去培养液。每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μL，震荡10min后，于490nm波长测A值，计算PA对各组细胞的生长抑制率。抑制率(%)=(1-A加药组/A对照组)×100%。　　1.2.4细胞凋亡的镜下观察在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的PS由脂膜内侧翻向外侧。AnnexinV是一种分子质量为35～36ku的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与PS有高度亲和力，故可

8、通过细胞外侧暴露的PS与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此，AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。碘化丙啶(PI)是一种核酸染料，它不能透过