gas表面蛋白fba保护性区段的鉴定与其表位的筛选

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1、中文摘要GAS表面蛋白Fba保护性区段的确定及其表位的筛选摘要目的：A族乙型溶血性链球菌(groupAstreptococcus．GAS)是链球菌中致病性最强的一种，可长期寄居于人体鼻咽部和肠道中，引起各种化脓性炎症、猩红热、丹毒、新生儿败血症、脑膜炎、产褥热以及链球菌变态反应性疾病等。临床上存在着反复感染和难以治愈等问题。如果将菌体表面蛋白作为疫苗，将刺激机体产生相应抗体，干扰链球菌侵入细胞，从而易于机体清除链球菌。候选的菌体蛋白中对M蛋白的了解最清楚，但由于M蛋白血清型太多，且M蛋白可能引起严重的变态反应，使得M蛋白作为疫苗的应用受到限制。世界各地不同实验室

2、的研究涉及到链球菌的F1蛋白、C5肽酶、链球菌糖、外毒素等，但免疫效果始终难以超越M蛋白。．TeraoY．等利用化脓性链球菌SF370网上公布的基因组序列，发现一新型菌体蛋白Fba，含有1068个核苷酸，编码355个氨基酸，分子量为37．8kdaEll。整个肽链从N端分为信号肽区，双螺旋结构区，富含脯氨酸区及C端的锚定区。它存在于13、22、28、44、49、60、67、75、77、79、80、82、87和89等多个血清型中，各型之间的Fba蛋白差异不大。实验结果显示表达Fba蛋白的GAS(Fba+GAS)侵入上皮细胞的能力较强。它还可以与补体调节因子FH、FH

3、L．1结合，以促进链球菌黏附、入侵上皮细胞及抗吞噬作用【2】，因此显示它对链球菌在体内的存活、毒力及致病性等中文摘要诸多方面的重要作用【3】。本室前期研究发现Fba蛋白可诱发与M蛋白相当的保护性免疫应答，因此Fba蛋白具备作为GAS疫苗候选蛋白的极其有利的潜质。本研究在已知A族链球菌表面蛋白Fba具有良好的免疫原性和免疫保护性的基础上，将分段克隆表达的Fba蛋白免疫动物并攻毒，以确定其具有保护性功能的区段。制备Fba蛋白的多抗，用纯化的抗Fba蛋白的多抗筛选噬菌体随机七肽库(Ph·D．7)，获得多个Fba蛋白抗原的线性表位及构象表位。方法：1．1根据Fba蛋白的

4、结构特点将其划分为四个重叠区域：37～l10aa、68～161aa、104～277aa、160～324aa。分别命名为Fbal、Fba2、Fba3、Fba4。大量表达Fba分段蛋白，亲和柱层析纯化后免疫动物。1．2将雌性Balb／c小鼠分为五组，每组8只，分别为FbaAl蛋白组、FbaA2蛋白组、FbaA3蛋白组、FbaA4蛋白组及PBS对照组，各组均以相同剂量蛋白免疫小鼠并加强免疫两次，每次免疫均间隔两周，并在每次免疫前内眦取血，末次免疫后两周取血。1．3ELISA检测各免疫组血清IgG水平。使用致死量的GAS(M+Fba+)攻击免疫三次后的小鼠，计算各组的保

5、护率。2．1将纯化的Fba蛋白免疫新西兰兔，以相同剂量蛋白免疫四次，每次免疫均间隔两周，末次免疫后两周颈动脉取血处死。ELISA检测兔血清IgG水平。纯化抗体，ELISA检测纯化后抗体水平。2．2采用纯化的IgG筛选噬菌体随机七肽库，经3轮中文摘要生物淘洗后，随机挑取分隔良好的克隆，通过夹心ELISA试验检测其与多抗的亲和力，挑选其中亲和力高的21个噬菌体克隆，提取单链DNA并测序。根据测序结果推导出其氨基酸序列，再与Fba蛋白序列进行比较分析，推断Fba蛋白的表位。结果：1．1经SDS．PAGE分析显示成功表达并纯化了Fba分段蛋白。1．2将纯化的Fba分段蛋

6、白免疫动物，实验组血清IgG产生呈逐渐增高趋势，其中以Fba2蛋白组效价升高最为明显，达1：102400，依次为Fba3、Fba4及Fbal蛋白组。1．3攻毒后5天，PBS组小鼠全部死亡，各实验组连续观察两周后依然有多只小鼠存活，各组保护率为Fba2蛋白组50％、Fbal、Fba3及Fba4蛋白组均为25％，经SPSS统计分析各实验组与PBS组保护率有显著差异。2．1纯化的Fba蛋白免疫新西兰兔后获得高IgG水平抗体。成功纯化多抗。2．2经过三轮筛选后，获得了高亲和力的噬菌体克隆。对21株噬菌体克隆测序，推导出线性表位15个，构象表位3个。结论：1FbaA2段可

7、诱导较强的保护性免疫应答。2获得了多个Fba蛋白抗原表位。关键词：A族链球菌(GAS)；Fba蛋白；免疫原性；噬菌体肽库；抗原表位英文摘要InvestigationofProtectiveTruncatedProteinandPanningtheEpitopesofFbaProteinABSTRACTObjective：GroupAStreptococcus(GAS)，astrongpathogenicbacteriawhichcauseavarietyofpurulentinflammation，scarletfever，erysipelas，neonatal

8、sepsis，menin