生物信息学筛选的合成小肽抑制vegf诱导小鼠角膜新生血管实验的研究

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1、生物信息学筛选的合成小肽抑制VEGF诱导小鼠角膜新生血管实验研究摘要血管新生，即在预先存在的血管中长出新生毛细血管的过程。它是多种致盲性新生血管性眼病的共同病理生理基础。血管新生严格地受到促血管因子和抑血管因子平衡的调控。这种平衡的打破，能够促发血管新生的细胞转导信号，引起血管内皮细胞的增生、迁移和存活，从而导致病理性的血管新生。血管内皮细胞生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)，作为复杂的血管新生瀑布反应的中心介质和强大的通透性因子，是迄今为止唯一被证实仅对内皮细胞特异性作用的促血管因子，并在血管形成中发挥关键作用

2、。Kringle结构域是一种由约80个氨基酸组成的保守结构，包含三对二硫键，是行使生物学功能的独立折叠单元。现已证实，Kringle结构域存在于包括生长因子、蛋白酶和凝血因子等多种不同功能的蛋白质，如纤溶酶原中。鼬dngle结构域被认为是首个特异性抑制血管生长的保守结构的组成部分，许多Kringle结构域能够抑制血管新生，如纤溶酶原ICringle5。脂蛋白(1ipoprotein)是血浆中的脂质与特殊蛋白质结合的球状巨分子复合物，脂蛋白中的蛋白质即载脂蛋白(apolipoprotein)。脂蛋白(a)[Lipoprotein(a)，Lp(a)]，含有载脂蛋白B

3、100(ApoBl00)和载脂蛋白(a)【Apo(a)】两类载脂蛋白。在包含Kringle结构域的蛋白质中，载脂蛋白(a)(apolipoprotein(a)，apo(a))包含几个随机重复的与纤溶酶原Z_ringle4类似的Kringle区域(KringleIV)，后面带有一个与纤溶酶原“n西e5同源的IOingleV结构域以及蛋白酶区域。已有一些研究揭示，apo(a)的这些结构也有类似于纤溶酶原相关Kring；1e结构域的抗新生血管活性，但apo(a)发挥抗血管新生活性的关键区域尚未得到清楚的阐明。因此，确定各结构域的抗血管新生活性位点及其潜在机制，对于更深

4、入地认识包含多Kringle结构的血管生成抑制剂的功能具有重要意义。出于此目的，我们选择apo(a)中与纤溶酶原K5唯一同源的KV结构域，应用生物信息学手段分析预测其氨基酸序列的结构和生物学特性，筛选出其中的一个ll肽片段YTMNPRKLFDY，人工合成后观察其对VEGF诱导的小鼠角膜新生血管的作用，初步探讨apo(a)抗新生血管活性区域所在，并为进一步开发治疗眼部新生血管疾病的分子药物奠定基础。第一部分生物信息学分析筛选小肽目的：利用生物信息学的方法，对apo(a)KV的氨基酸序列进行分析，预测其抗新生血管的活性氨基酸位点所在。方法：登陆美国国立生物技术信息中

5、心(NationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBI)网站主页(httm／／www．ncbi．nlm．nih．gov／)，进入NCBI默认的蛋白质数据库NRDB蛋白质序列复合数据库，查询“apolipoprotein(a)krine,leV”·进入网站中的StandardProtein-ProteinBLAST(BLASTp)子程序，提交查得的apo(a)KV氨基酸序列。打开I．．asergene软件包，进入Protean程序，进行抗原性、表面接触性分析和氨基酸组成分析；打开BioEdit软件包，行氨基酸组成分析和疏水

6、面平均数的计算。综合分析上述结果。结果：在NRDB蛋白质序列复合数据库中查找得到人apo(a)apo(a)KV(4227-4327)序列如下：DCMFGNGKGYRGKKATTVTGTPCQEWAAQEPHRHSTFmGTNKWAGLEKNYCRNPDGDINGPWCYTMNPRKLFDYCDIPLCASSSFDCGKPQVEPKKCPGS。BLAST程序分析该序列显示了apo(a)KV与纤溶酶原K5含有85％的相同氨基酸残基，91％的相似氨基酸残基(Expect=1e-51)。推测apo(a)KV中保守氨基酸分布较集中的区域可能存在抗新生血管活性位点。根据上述

7、同源性比较结果，结合apo(a)KV空间结构，以二硫键为界，将apo(a)KV分成4个肽段，依次为Pept1一Pept4，分别进行生物学特性分析。抗原性分析显示，在apo(a)KV第5—15、50--60、65--75、90--100氨基酸残基区域出现较大的抗原性波峰，这些区域分别位于Peptl大部分、Pept3前段和Pept4全段。在表面接触性分析中，在apo(a)KV第10一15、30一35、65—75、90一95氨基酸残基区域出现表面接触性波峰，对应的区域为Pcptl中段、Pept2前段和Pept4全段。疏水性分析显示，PeDt3和Pelt4各形成一个亲水

8、性谷底。Pept1一Pe