以sirna表达载体介导的rna干涉法建立人细胞色素b5还原酶缺陷的细胞模型

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1、第二军医大学硕士学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意．本人承担本声明的法律责任。学位论文作者签名：声岳明勃签字日期：Mg年r月呷日学位论文使用授权书声明本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阗。本人授权第二军医大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇

2、编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：声岳_骑拳导师签名签字日期：砌6年s月彳日签字日期：确6年≤月‘听日第二军医大学硕士学位论文Ampb5RbpBSAcD_NA4．CNdDEPCDCIPdNTPDTTDMS0EBEDTAFADGAPDHHRPhHMl(Dkb英文缩略词表ABBRIVIArIoNS氨苄青霉素NADH．细胞色素b5还原酶碱基对牛血清白蛋白互补DNA4．氯．1-萘酚日焦碳酸二乙酯2，6．二氯酚靛酚脱氧三磷酸核苷二硫苏糖醇二甲亚砜溴化乙啶乙二胺四乙酸黄素腺嘌呤二核苷酸3．磷酸甘油醛脱氢酶辣根过氧化物酶小时遗传性高铁血红蛋白血症千道尔顿千碱基对第二军医大

3、学硕士学位论文LBmlnMTTMMCNADH0DR妞PBSPCRRNAiRTRCMsiRNAsllRNASDSSeCTEMEDLB培养基分噻唑蓝丝裂霉素C还原型辅酶I光密度聚丙烯酰胺凝胶电泳磷酸盐缓冲生理盐水聚合酶链反应RNA干涉逆转录隐性先天性高铁血红蛋白血症小干涉鼢舱小发夹RNA十二烷基硫酸钠秒四甲基乙二胺第二军医大学硕士学位论文以siRNA表达载体介导的RNA干涉法建立人细胞色素b5还原酶缺陷的细胞模型摘要NADH一细胞色素b5还原酶(简称b5R)是一种具有重要生理功能的氧化还原酶类．以胞浆可溶型和膜结合型两种形式存在于体内山5R基因突变将导致隐性先天性高铁血红蛋白血症(RcM)。本课

4、题利用RNA干涉(RNAj)技术，应用网络在线软件设计并合成两条靶向人b5RmRNA的siRNA模板片段，分别将其克隆至经过改建、带有neo基因的pSn∞cHl．0-U6载体上，构建成silⅢA真核表达载体pSib5R-l和口sib5R_2。重组载体通过酶切和DNA直接测序鉴定。分别将两种重组质粒脂质体转染法瞬时转染人肺成纤维细胞和BEL．7402肝癌细胞株，半定量RT-PCR和荧光定量RT-PCR分析b5RmRNA的表达抑制效率。结果显示，pSIb5R．1对两种细胞b5R基因的表达无明显影响，psib5R五对成纤维细胞b5RmRNA的抑制率达81．7％，对BEL．7402细胞b5RmRNA

5、的抑制率达60％，说明两种细胞b5R基因的表达均可被pS．b5R_2介导的RNA干涉有效抑制。对pSib5R-l、pSib5R_2转染的BEL-7402细胞，采用G418进行筛选，共获得共获得18个细胞克隆：其中空载体5个，psib5R-l5个，psib5R一28个。经PcR鉴定证实，各个克隆均稳定整合有熏组载体或空载体。对各稳定转染的细胞克隆在b5RmRNA水平、酶活性、酶含量等方面进行干涉效果的鉴定．结果显示，psib5R-2转染的克隆中有两个克隆b5mnRNA抑制率达48．2％和56．2％；酶活性抑制率为38．4％和48．5％；酶含量也有明显降低。对b5R酶缺陷的细胞克隆采用MTT法测

6、定细胞的生长曲线，发现b5R酶缺对b5R酶缺陷的细胞克隆采用M订法测定细胞的生长曲线，发现b5R酶缺第二军医大学硕士学位论文陷没有改变细胞的生长速度。采用MTT法，通过不同浓度的丝裂霉素以及丝裂霉紊处理后的不同时间点对b5R酶缺陷和正常的BEL，7402细胞的生长抑制率进行比较，发现b5R酶缺陷并没有降低丝裂霉素抑制BEL-7402细胞的敏感性。本研究成功构建了b5RsiRNA表达载体，建立b5R酶缺陷的BEL一7402的细胞模型，为进一步研究b5R基因的功能以及探讨II型I配M的发生机制提供了实验依据和材料，同时也为将来建立b5R缺陷的实验动物模型和相关遗传病的基因治疗打下了基础。关键词：

7、NAD}I．细胞色素b5还原酶；隐性先天性高铁血红蛋白血症；RNA干涉；小干涉RNA；表达载体：细胞模型第二军医大学硕士学位论文EstabIishmentofaceIIularmodelwithhumanNADH-cytochromeb5reductasedeficiencyViasiIU临expressingvecto卜basedRNAintemrenceAbstI·actNADH·cytochromeb5