细胞色素b5与细胞色素c电子传递的研究

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1、复旦大学硕士学位论文细胞色素b<,5>与细胞色素c电子传递的研究姓名：任毅申请学位级别：硕士专业：无机化学指导教师：王韻华20030511细胞色素b，与细胞色素c电子传递的研究摘要电子传递反应在生物体的光合作用、呼吸作用、药物代谢以及其它一些生化途径中具有重要地位，研究蛋白之间电子传递的机制、调控因素等一直是化学生物学领域的重要课题。细胞色素bj是含血红素的电子传递蛋白。它与细胞色素c之间的电子传递，是研究蛋白质电子传递机制的理想体系。本论文以二十余种细胞色素b5的突变体蛋白为研究对象，对细胞色素b5和细胞色素C的静电识

2、别、电子传递通道等问题进行了研究。细胞色素b，在与细胞色素c进行电子传递的过程中，蛋白和蛋白之间存在着多种相互作用，如细胞色素bj血红素暴露于溶剂一侧高度密集的带负电荷的基团Glu44、GIu48、Glu56、Asp60以及血红素丙酸根与细胞色素C表面带正电荷的氨基酸残基通过静电作用进行识别；细胞色素bj中的Val45和Val61分剔与细胞色素c的Ala81和Phe82存在疏水相互作用；Phe35、Pr040、Tyr74等残基组成了细胞色素bj表面疏水斑区，由它构成的氢键网络有可能为细胞色素bj和细胞色素c电子传递提供通

3、道等等。为了了解这些相互作用分别对电子传递过程的影响，我们进行了一系列的研究。以细胞色素bjE44A、E56A、E44／56A、E44／48A、E48／56A、E48A，D60A、E44／48／56A、E44／56A，D60A、E48／56A，D60A、E44，48／56山口60A和E43／44／48／56刖D60A突变体蛋白和血红素丙酸根甲酯化的衍生物DME—wT、DME—E44／48／56A／D60A等为对象，系统的研究了静电作用对细胞色素bs／细胞色素c结合和电子传递的影响。以V45E、V45H、V61E、V61H

4、等细胞色素b5突变体蛋白为对象，研究疏水相互作用对细胞色素b5和细胞色素c结合和识别发挥的作用。此外，还以F35Y、F35L、P40V等突变体蛋白为对象，探讨细胞色素b5表面疏水斑区在电子传递过程中的作用。蛋白质分子的功能与其结构、性质息息相关，研究突变体蛋白的结构和基本性质是深入理解特定的基团对蛋白发挥生物功能影响的基础。本实验室前期对细胞色素bJE44／E56A、E44／48／56A／D60A等突变体蛋白的NMR研究表明这些突变并没有引起蛋白整体结构的变化。在此基础上，本论文首先就细胞色素b5表面带负电荷的氨基酸残基

5、Glu44、Glu48、Glu56、Asp60及血红素上的丙酸根对蛋白的稳定性及氧化还原电位的影响进行了研究。我们发现Glu44、Glu48、Glu56、Asp60等残基突变为Ala后不同程度的提高了细胞色素bj的稳定性，这主要是因为突变以后疏水自由能有所增加，而且细胞色素bj旺一螺旋中电荷与偶极的相互作用也更为有利。同时这些突变体蛋白仅引起细胞色素bj氧化还原电位10mV以内的变化。血红素上的丙酸根甲酯化的衍生物则由于血红素辅基与蛋白肽链之间失去了两个氢键的相互作用而稳定性降低，并且电位也有较大改变。本文采用紫外～可见

6、差谱方法，测量了细胞色素bj突变体蛋白和细胞色素细胞色素b，与细胞色素c电子传递的研究C的结合常数。结果表明：Glu44、Glu48、Glu56、Asp60和血红素丙酸根上的负电荷的中和，都减弱了两个蛋白分子之间的结合能力，并且中和的电荷数越多，这种变化越明显。我们注意到，这些基团所带负电荷的中和只是减弱细胞色素b和细胞色素C结合的能力，并不完全破坏它们之间的结合，溶液中应该存在着多种静电相互作用的模式。V61E、V61H、V45H等细胞色素bj突变体与细胞色素c的结合常数都与野生型相当。我们认为疏水相互作用的贡献并不很

7、大，而静电相互作用在细胞色素如和细胞色素c结合过程中发挥着至关重要的作用。分别用动力学快速停流法和激光闪光光解法研究了细胞色素b，和细胞色素C(锌取代细胞色素c)在高离子强度下的电子传递过程。动力学快速停流法的结果表明，对于与细胞色素c结合能力差别不大的细胞色素bj突变体蛋白(F35Y、F35L、P40V、V45E、V45H、V61E、V61H等)，电子传递的热力学驱动力越大，其速率就越快。表面荷负电残基(Glu44、Glu48、Glu56、Asp60和血红素上的丙酸根)的突变体蛋白，它们与细胞色素c电子传递速率和与细胞

8、色素c的结合能力大致成正比。根据Marcus理论，研究了热力学驱动力与电子传递速率的关系，并得到该电子传递体系的重组能为O．6eV。本文还用激光闪光光解法研究了细胞色素bj和锌取代细胞色素c在低离子强度下的复合物分子内电子传递过程。在这种条件下得到的是溶液中稳定存在的蛋白复合物的分子内电子传递速率常数。F35Y、F3