共表达dll4，p16基因真核表达载体构建与对白血病细胞的影响

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1、共表达d114，p16基因真核表达载体构建及对白血病细胞K562的影响摘要目的：本文构建真核基因双表达载体pBudCE4．1．d114．16，并将构建的真核双表达载体通过Lipofectamine2000转染慢性粒细胞白血病细胞株K562，观察目的基因在白血病细胞株K562中的表达情况，进而研究其对白血病细胞增殖情况的抑制作用，为进一步研究多种基因同时用于肿瘤治疗奠定一定基础。方法：本文构建真核双表达载体pBudCE4．1．d114．16，该载体包含野生型dll4cDNA、p16cDNA基因，同时构建对照组质粒pBudCE4．1．d

2、114、pBudCE4．1．16。通过脂质体法将各组质粒转染入白血病细胞K562中，分为三阶段：一是转染48小时后，收集各组细胞，用RIPA裂解细胞，免疫印迹法检测外源性目的基因瞬时转染的表达水平；二是通过CellCountingKit．8(CCK．8)，描绘各试验组细胞的生长曲线；三是转染48小时后，经70％预冷乙醇固定，PI染色后，通过流式细胞仪检测各试验组细胞的周期分布情况。结果：本实验成功构建了真核表达载体pBudCE4．1．d114、pBudCE4．1．16及真核双表达载体pBudCE4．1．d114．16，通过限制性核酸

3、内切酶酶切方法鉴定插入基因的位点与预期相符。通过脂质体法将各组质粒成功转染入白血病细胞株K562中，转染后48小时，采用免疫印迹技术检测到野生型d114、p16基因在白血病细胞K562中的表达水平：实验组(质粒pBudCE4．1．d114．16转染组)和对照组l(质粒pBudCE4．1．16转染组)细胞均表达P16蛋白，其余三组均不表达；实验组(质粒pBudCE4．1．d114．16转染组)及对照组2(质粒pBudCE4．1．d114转染组)细胞均高度表达d114蛋白，其余三组均中度表达。转染48小时后，通过PI染色处理，经流式细胞

4、仪检测各组细胞的细胞周期分布情况，相比较于对照组，实验组细胞Go／G1期增多，差异有显著统计学意义(P<0．001)。细胞生长曲线显示，细胞生长受到明显抑制，尤其是实验组细胞。结论：重组的双表达质粒pBudCE4．1．d114．16能在白血病细胞K562中共同表达目的基因，诱导细胞周期停滞于Go／Gl期，抑制细胞生长，但不诱导细胞凋亡。关键词：d114基因p16基因pBudCE4．1质粒构建基因转染共表达周期ConstructionofRecombinantPlasmidpBudCE4．1·d114-16anditsEffecton

5、LeukemicCellsK562Abstractobjective：Thisarticleconstructsavectorcontaininghumansuppressorgened114andpl6INK4a,usestheLipofectamine2000todrythed114andp161NK48intotheLeukemiccelllineK562，andobservingitsexpressionandfunctioninLeukemiccells．Tofurtherstudymanykindsofgenestous

6、einthetumortreatmentlayingthefoundation．Methods：RecombinantplasmidpBudCE4．1一d114—16wasdesignedandconstructedforsimultaneousexpressionofhumansuppressorgenesd114andpl6INK4ainmammaliancellline．AftertransfectedintoLeukemiccellsK562withlipfectamine聊2000，dividesintothreestag

7、es：First，theextensiondyes48hourslater,collectseachgroupofcells，decomposesthecellswithRIPA，theexpressionofd114andpl61NK4ageneswasdetectedbyWestern．immunobltting；Second，ThecellproliferationWasassessedbyCCK·8；Third，thechangesincellcycleWasevaluatedbyflowcytometry．Results：

8、TheserecombinantplasmidspBudCE4．1-d114-16、pBudCE4．1一d114andpBudCE4．1—16wereconstructedsuccessfullyandwereverifiedbyre