gntv+rnai对人前列腺癌pc3细胞侵袭和增殖能力的影响

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1、50岁以上男性的前列腺癌发病率为0．78％，提示中国的前列腺癌实际发病率并不低。因此，寻找前列腺癌有效治疗方法已成为一个急待解决的世界性公共卫生问题。生物体内的大多数蛋白质都以糖蛋白的形式存在，糖蛋白中的糖链直接影响着糖蛋白生物功能的发挥。N．糖链的结构改变是细胞恶性转化的关键步骤，在肿瘤细胞中，复杂糖链的结构发生异常改变，且这种变化与肿瘤侵袭转移密切相关。N一乙酰氨基葡萄糖基转移酶V(N．aeetylglucosaminyltransferaseV，GnT—V)是一个与肿瘤及肿瘤转移相关的酶，研究表明GnT-V在很多恶性肿瘤中增多，其产物GIcNAel]I，6Manal，6结构有利于外链的延

2、伸，已发现该结构与细胞的恶性转化和肿瘤的转移有密切关系。基因治疗是一种有前景的肿瘤治疗手段，RNA干扰(RNAinterference，RN加)技术是近年来迅速发展起来的一项新的基因功能研究手段，它是利用与靶基因同源的小片段双链RNA(dsRNA)，即siRNA，转染靶细胞，促进靶基因mRNA降中文摘要解，从而特异性诱导转录后基因沉默。将siRNA所对应的模板DNA双链序列克隆入质粒转染细胞，DNA模板在细胞内转录成小片段发夹状RNA(shRNA)，与化学合成的小干扰RNA(si对蛆)具有相同的基因封闭作用，但作用时间可长达2个月，因其特异性和高效性成为当前肿瘤基因治疗的热点。本实验利用RNA

3、i原理和技术，针对前列腺癌中高表达基因GnT．V的shRNA表达质粒，将其转染高转移潜能的人前列腺癌PC．3细胞，观察RNAi对GnT-V基因表达的抑制效应，寻找抑制效率较高的RNAi片段，为寻找有效治疗前列腺癌分子靶向研究中新靶点提供实验依据。【实验方法】1、pGPU6／GFP／NeoGnT-VshRNA质粒的构建及鉴定(1)GIlT-VsiI矾A序列的设计：根据NCBI数据库中GnT-V基因已知序列(NM002410．3)和siRNA设计原则，设计针对GnT_VcDNA的RNA片段，其序列为：GnT．V／1079sense’GGAAGTGCAT(ⅪAACTGl_盯A3q经Blast检索确认

4、与GnT—V以外的人类已知基因序列无同源性。将其中一对的序列打乱排列，通过Blast分析无同源性超过70％的序列，作为阴性对照干扰序列，序列为：GnT．V／NCsense5’GTTCTCCGAACGTGTCACGT37。由上海吉玛公司采用化学合成方法合成上述siRNA。(2)shRNA转录模板DNA的设计：根据前面设计的siRNA序列，设计模板DNA链，其顺序分别为BbsI酶切位点、正义序列、9ntloop连接序列、反义序列、RNA聚合酶ⅡI终止子(6个T)、BamHI酶切位点。(3)质粒pGPU6／GFP／NeoGnT-V的构建及鉴定：先将各组2条模板单链退火处理，再与双酶切后的pGPU6／

5、GFP／Neo质粒连接，构建成重组体质粒。将重组体转化大肠杆菌DH5Q，筛选卡那霉素抗性克隆，利用限制性内切酶BbsI和BamHI双酶切及测序鉴定重组质粒。大量扩增摇菌后，抽提质粒纯化。2、细胞培养与转染人前列腺癌细胞株PC．3在含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中，37℃、5％C02湿度下培养，每周传代2,--．3次。PC一3细胞培养至对数生长期，参照invitrogcnII硕士学位论文公司Lip0南渤Injlle2000刑产品说明书，用脂质体Lipofectamine2000TM将质粒导入Pc一3细胞。3、干扰效果检测(1)半定量逆转录聚合酶链反应(RT．PCR)检测GnT-VmRN

6、A表达转染成功后，继续培养PC．3细胞48h后，收集细胞，经Trizol一步法提取总RNA，采用AMV逆转录合成cDNA，进行PCR反应。GnT-V上游引物为5’AACTCTTGGACCATCCTGGG，rrC37，下游引物为5’TrGCTGClT丌GGGTGGGTT3’，产物长度为555bp。PCR反应条件：94"C预变性5min，94。C变性30s，40"C退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；最后72"12再延伸10min．以13-actin为内参，上游引物为57GAAACTACcTTCAACTCCATC37，下游引物为5’CGAGGCCAGGATGGAGcCGcC37，产物长度为

7、219bp。以扩增产物3ul在2％琼脂糖凝胶中电泳，摄像后使用Image．ProPlus6．0软件进行光密度分析，用CmT-V／13．actin灰度比值作为GIlT-V的相对表达水平。(2)蛋白质印迹(Westernblot)检测GnT-V蛋白表达转染成功后，继续培养PC-3细胞72h后，每组收集l×107个细胞，经细胞裂解液提取总蛋白并进行定量。取50ug总蛋白进行SDS---PAGE电泳完成后