Thapsigargin对前列腺癌PC-3细胞增殖、侵袭和凋亡的影响及其机制的实验研究.pdf

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1、分类号：R737.25密级：公开学校代码：11065学号：y0115130105专业博士学位论文Thapsigargin对前列腺癌PC-3细胞增殖、侵袭和凋亡的影响及其机制的实验研究作者姓名黄逢雨指导教师王新生教授专业领域外科学（泌尿外）培养单位医学部临床医学系答辩日期2018年5月13日Thapsigargin对前列腺癌PC-3细胞增殖、侵袭和凋亡的影响及其机制的实验研究摘要目的：我国前列腺癌的发病率近年来呈现快速上升的趋势。几乎所有前列腺癌患者经过内分泌治疗后最终都会发展成为去势抵抗性前列腺癌（CRPC），对于去势抵抗性前列腺

2、癌，治疗效果欠佳，因此迫切需要寻找更为有效的药物来延缓疾病进展。Thapsigargin（TG毒胡萝卜素）就是这样一种具有潜在治疗效果的药物。本实验通过体外培养前列腺癌PC3细胞系，研究TG对PC3细胞增殖、侵袭和凋亡的影响，并探讨TG可能的作用机制。方法：1.体外培养前列腺癌PC3细胞，添加不同浓度的TG（1nmol/l，10nmol/l，100nmol/l，1000nmol/l）作用于PC3细胞不同时间进行干预，与不加TG的同条件对照组进行比较。采用CCK-8法检测TG对PC3细胞增殖的抑制作用，并筛选出进一步实验的适合的TG

3、浓度；显微镜下观察TG作用后的PC3细胞的形态改变；细胞划痕实验和Transwell体外迁移实验检测TG对PC3细胞迁移和侵袭能力的影响；应用流式细胞仪检测TG对PC3细胞的细胞周期及凋亡率的影响。2.为探讨TG作用机制，荧光法检测计算TG导致的细胞内钙离子浓度变化；荧光探针检测内质网大小变化情况反映内质网病理变化程度；WesternBlot检测TG对内质网应激PERK、IRE1α和ATF6三条信号转导通路的影响；RT-PCR检测TG对PC3细胞内质网应激分子GRP78与CHOPmRNA的影响；分光光度法检测TG对PC3细胞内Ca

4、spase-3与Caspase-4活性的影响；WesternBlot检测细胞动力系统相关的Cofilin-1，p-Cofilin-1，F-actin，Paxillin，及p-mTOR，RhoA等蛋白表达情况的变化。SPSS19.0统计软件包对数据进行统计分析，计量资料用均数±标准差表示，采用T检验比较两组间均数的差异，采用One-WayANOVA检验比较多组均数的差异，当p＜0.05时认为差异具有统计学意义。结果：1.应用CCK-8法测定TG对PC3细胞在作用不同时间后的生长抑制作用。同对照组相比，实验组中不同浓度的TG(浓度分别

5、为1nmol/l,10nmol/l,100nmol/l,1000nmol/l)分别作用12，24和48小时后，表现出对PC3细胞的抑制作用。其中10nmol/lI的TG在培养24，48小时后，100nmol/l在培养12，24和48小时后，其细胞活力分别为85.2%，79.1%，86.0%，76.7%，65.0%，差异具有统计学意义。结果显示，随着TG浓度增加和作用时间延长，TG对PC3细胞抑制作用在逐渐增强，在一定浓度时间范围内基本呈线性关系。当药物浓度达到1000nmol/l时，从OD值看，其线性较差，48小时的细胞活力降到5

6、0%以下，细胞破坏严重，不利用进一步的研究，所以，后续的试验选用1nmol/l，10nmol/l和100nmol/l三个TG浓度进行进一步研究。2.显微镜下观察对照组（TG浓度为0nmol/l）PC3细胞形态饱满，细胞排列紧密，贴壁生长良好，胞体较大，胞质均匀，胞核大小较规则。而经过不同浓度的TG处理后，实验组细胞增殖缓慢，形态发生改变。随着TG浓度增加及作用时间延长，部分细胞体积缩小，形态变得不规则，细胞之间间隙增大，胞质内出现空泡，核质比增大，部分细胞核浓缩，核仁数目减少等细胞凋亡的形态学改变。3.采用细胞划痕试验检测TG对P

7、C3细胞迁移能力的影响。低浓度TG（1nmol/l）作用于PC3细胞12小时，24小时和48小时后的迁移抑制率分别为16.3%，27.8%，33.3%。随着TG作用时间的延长，对PC3细胞具有显著的迁移抑制作用。Transwell体外迁移模型主要观察列腺癌PC-3细胞的迁移和变形能力。采用包被Matrigel基质胶的Transwell检测PC3细胞的侵袭能力。结果显示，TG处理后的PC3相对侵袭性分别降为42.6%和28.9%，提示低浓度TG即可显著降低前列腺癌细胞系PC3细胞的迁移和侵袭。4.通过AnnexinV-FITC和PI

8、双标记流式细胞检测不同TG浓度培养24小时后PC3细胞的凋亡情况，对照组（TG0nmol/l）培养PC3细胞凋亡率为4.660.85%，随着TG浓度的升高，凋亡率为5.831.84%，16.164.07%和24.8610.09%，其中TG1