hlaa2限制性nyeso1抗原特异的tcr基因转导人外周血t淋巴细胞过继免疫治疗肝癌的初步的研究

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1、安徽医科大学硕士学位论文HLA-A2限制性NY-ESO-1抗原特异的TCR基因转导人外周血T淋巴细胞过继免疫治疗肝癌的初步研究中文摘要目的：检测肝细胞性肝癌(hepatocellularcarcinomaHCC)患者肝癌组织中癌-睾丸抗原NY-ESO-1（NewYorkesophagealsquamouscellcarcinoma1)基因和蛋白水平的表达，为HLA-A2限制性NY-ESO-1抗原特异的TCR基因转导的人外周血T淋巴细胞过继免疫治疗肝癌进行可行性研究。建立高表达NY-ESO-1抗原的肝癌细胞株（HepG2）做为NY-ES

2、O-1TCR基因转导的T细胞在体外特异性免疫识别与杀伤实验的靶细胞。构建HLA-A2限制性NY-ESO-1抗原特异的T细胞受体（TcellreceptorTCR）的真核表达载体，使其在HLA-A2基因型的健康人外周血T淋巴细胞中表达。方法：120例HCC石蜡组织制成病理切片，应用免疫组织化学(immunohistochemistryIHC)两步法对HCC病人的癌组织、相应的癌旁非癌组织标本NY-ESO-1蛋白表达和分布情况进行检测。用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法对99例HCC病人的癌组织标本进行NY-ESO-1mRNA检测

3、。利用RT-PCR法从睾丸癌组织标本中获得NY-ESO-1全长基因，并克隆到载体pCDNA3.1上，获得质粒TMPCDNA3.1/NY-ESO-1。用脂质体Lipofectamine2000将该真核表达载体转染人肝癌细胞系（HepG2）细胞，G418筛选后用RT-PCR及间接免疫荧光法检测NY-ESO-1在HepG2细胞中的表达，获得了高表达NY-ESO-1的HepG2细胞株。通过PCR扩增获得HLA-A2限制性NY-ESO-1TCR基因，并克隆到载体pCDNA3.1上，获得质粒PCDNA3.1/NY-ESO-1TCR。将质粒PCDN

4、A3.1/NY-ESO-1TCR单酶切成为线性模板，体外转录为mRNA，AmaxaNucleofection电转仪将其导入人外周血单个核淋巴细胞，用FITC标记的anti-TCRVβ13.1对上述细胞进行染色，流式细胞术检测电转后T细胞的TCR基因转导效率。结果：（1）NY-ESO-1蛋白在癌旁组织中无表达，在120例肝癌组织中的阳性率为27.5%（33/120）。阳性部位大部分位于细胞浆，少量位于细胞核。NY-ESO-1mRNA1安徽医科大学硕士学位论文在99例肝癌组织中的阳性率为46.5%（46/99）。（2）用限制性内切酶酶切及

5、PCR法检测真核表达载体PCDNA3.1/NY-ESO-1及PCDNA3.1/ESOTCR，结果显示两个载体均构建成功。经DNA序列分析，结果显示，在克隆中，各碱基均按照预期的顺序正确地组装成全长的目的DNA编码序列，没有发生碱基的重复和缺失现象。（3）获得了高表达NY-ESO-1抗原的肝癌细胞株（HepG2），RT-PCR、间接免疫荧光检测表明肝癌细胞系（HepG2）细胞经质粒PCDNA3.1/NY-ESO-1转染和G418筛选后稳定的高表达NY-ESO-1基因和蛋白，NY-ESO-1蛋白在细胞浆和核中均有表达。（4）真核表达载体P

6、CDNA3.1/ESOTCR在体外转录的mRNA经RNA电泳和RT-PCR鉴定+表明其为目的片段。HLA-A2基因型健康人外周血PBMC在体外经IL-2、抗CD3抗体诱＋导5天，再ESOTCRmRNA电转24h后流式细胞术检测：CD3表达上调，CD8T细胞TCR＋阳性表达细胞为：22.62％，CD4T细胞TCR阳性表达细胞为：1.86％。结论：（1）NY-ESO-1mRNA和蛋白在肝癌组织中高特异性表达，以其为靶标进行HLA-A2限制性NY-ESO-1抗原特异的TCR基因转导的人外周血T淋巴细胞过继免疫治疗肝癌的研究具有可行性。（2）

7、建立了高表达NY-ESO-1抗原的肝癌细胞株（HepG2），使其成为NY-ESO-1TCR基因转导的T细胞在体外特异性免疫识别与杀伤实验的靶细胞。+（3）用RNA电转的方法使HLA-A2基因型健康人外周血T细胞表面表达了NY-ESO-1TCR，为下一步检测转导后T淋巴细胞的功能以及HLA-A2限制性NY-ESO-1抗原特异的TCR基因转导的人外周血T淋巴细胞在体外特异性识别和杀伤肝癌细胞的研究奠定了基础。关键词NY-ESO-1肝癌真核表达载体RNA电转过继免疫治疗2安徽医科大学硕士学位论文PrimaryHumanLymphocytes

8、TransducedwithHLA-A2Restricted、NY-ESO-1Antigen-specificTCRGenesforUseinAdoptiveImmunotherapyforHepatocellularC