基因半相合肿瘤特异性t淋巴细胞在肿瘤免疫治疗中的应用研究

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1、河北医科大学博士学位论文基因半相合肿瘤特异性T淋巴细胞在肿瘤免疫治疗中的应用研究姓名：崔乃鹏申请学位级别：博士专业：外科学指导教师：蔡建辉201204中文摘要基因半相合肿瘤特异性T淋巴细胞在肿瘤免疫治疗中的应用研究摘要过继免疫细胞回输治疗已成为目前公认的肿瘤治疗新战略、新方法。近年来，主要的研究方向是通过改进各种方法希望能在获得更佳的治疗效果的同时尽量减少毒副反应。肿瘤免疫治疗的总体效果不令人满意，是因为肿瘤微环境中复杂多变的免疫抑制网络限制了免疫治疗的实际效果，这些抑制因素是困扰肿瘤免疫治疗的关键。本研究希望能找到

2、一种临床实践中成熟可靠且简便易行的方法来在抑制这些免疫抑制因素的基础上提高恶性肿瘤的免疫治疗疗效。目前临床上常用的干扰肿瘤微环境方法是全身化疗，但是以环磷酰胺为代表的化疗药物本身对恶性肿瘤就有一定的治疗效果，对免疫治疗的效果判定存在一定的干扰，所以本次研究采用了全身放射线照射(totalbodyirradiation，TBI)的方法来干扰肿瘤微环境。根据既往的研究结果，荷瘤小鼠经清髓剂量TBI后需经骨髓移植(bonemarrowtransplantation，BMT)才能继续存活以完成进一步的实验观察，这在实际临床应

3、用中无疑是很难实现的，所以本研究设计了第一部分实验通过观察经不同剂量的TBI后各组荷瘤小鼠的生存情况来筛选适宜的TBI剂量。进一步的实验设计通过检测荷瘤小鼠调节性T淋巴细胞(regulatoryTcell，Treg)和IL．10等指标在放疗前后的水平区别来了解肿瘤微环境的变化程度。在目前的临床应用中，主要使用的是自体来源的肿瘤特异性效应细胞回输，这样产生的移植物抗宿主反应(graft．versus．hostdisease，GVHD)很轻，大多病人可以耐受。可是越来越多的临床实践证实，因受制于个体病情的复杂性，尤其是对

4、于晚期病人和骨髓瘤病人来讲，获得足够数量和质量的自体来源的肿瘤特异性效应细胞往往很困难。使用同种异体来源的效应细胞回输治疗也许会产生一定的疗效，但是往往会因导致病人不可耐受的移植物抗宿主反应而被迫中止。已有研究证实，反复数次回输效应细胞会产生更为理想的治疗效果，但是回输同种异体来源的效应细胞会因在主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)方面的中文摘要不匹配而产生很严重乃至于致死性的副反应。近十几年来，半相合基因(haploidenticalgene)概念已经在国内外

5、广泛应用于血液病领域治疗白血病、再生障碍性贫血等疾病，并取得了令人鼓舞的疗效。从基因配型上来讲，除个别独生子女外，绝大多数病人可从直系亲属中找到拥有半相合基因的供者。如果能将半相合基因方法应用于实体肿瘤生物治疗，可极大的扩展肿瘤生物治疗的指征，使更多的患者能增加一种治愈肿瘤的机会。基于这种思路，本研究设计以B16细胞负载于C57BL／6小鼠，采用半相合基因鼠CB6FI(BABL／C×C57BL／6的杂交子一代，简称F1代)作为免疫治疗效应细胞供者，探索在临床实践中采用健康直系近亲属作为效应细胞供者的可行性，并观察移植

6、物抗宿主反应(GⅥD)程度。第一部分不同剂量全身放射线照射对肿瘤生长和荷瘤小鼠生存的影响目的：观察不同剂量全身放射线照射后荷瘤鼠的生存及肿瘤生长情况，筛选出适宜的全身照射剂量。方法：通过皮下接种B16细胞株制备恶性黑色素瘤荷瘤小鼠模型；以5Gy和7Gy的不同剂量分别对小鼠进行TBI，高剂量组小鼠部分给予BMT，观察小鼠的存活情况；同时观测各组小鼠肿瘤的大小变化，绘制肿瘤生长曲线，评价放疗剂量对肿瘤生长的影响。结果：1．C57BL／6小鼠经皮下接种B16黑色素瘤细胞株7天后可见小鼠皮下明显的黑色结节，形态学结果显示肿瘤

7、模型建立成功。2．进行不同剂量的放射线照射处理后与对照组相比，各组小鼠生存期无明显差异。3．荷瘤小鼠进行不同剂量的放射线照射处理，O、5、7Gy及7Gy+BMT。放疗后每三天测量肿瘤面积。与对照组相比，接受5GyTBI、7GyTBI及7GyTBI+BMT放射线照射处理的荷瘤小鼠其肿瘤面积无显著性变化。结论：接受5GyTBI、7GyTBI及7GyTBI+BMT放射线照射处理的荷瘤小鼠其肿瘤面积与对照组相比无显著性变化。7Gy放疗后不给予骨髓移植不影响荷瘤小鼠的生存。第二部分全身放射线照射对荷瘤小鼠肿瘤微环境的影响目的：

8、观察放疗处理对B16荷瘤小鼠肿瘤微环境的影响。方法：B16荷瘤小鼠于植瘤10天后接受7GyTBI放疗处理，于放疗后l、3、5、7、9、11、13天取小鼠外周血检测白细胞水平。应用ELISA试剂盒检测小鼠血清IL．10蛋白水平，实时定量RT-PCR检测小鼠脾组织中文摘要中IL．10mRNA和CD4+CD25+Foxp3+T细胞含量。结果：1．B1