tall患者外周血tcrγ-δ t细胞的分布和增殖特点

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1、TALL患者外周血TCRγ/δT细胞的分布和增殖特点：查显丰,李扬秋,陈少华,杨力建,李萡,郁志【摘要】　　目的:了解T细胞急性淋巴白血病（Tcellacutelymphocyticleukemia,TALL）患者外周血TCRVγ和Vδ亚家族T细胞的分布和克隆情况。方法:利用RTPCR扩增9例TALL患者和10例正常人外周血单个核细胞中3个TCRVγ和8个Vδ亚家族基因的互补决定区3（CDR3）,了解TCR亚家族Vγ和Vδ亚家族细胞的分布;阳性产物进一步经基因扫描分析CDR3长度,从而了解其克隆性。结果:9例TALL患者3个Vγ亚家族

2、的表达率都明显低于正常人Vγ亚家族的表达率（P<0.05）;Vδ亚家族中只有Vδ1和Vδ3的表达率低于正常人（P<0.05）。3例TALL患者出现克隆性增殖的γ/δT淋巴细胞。结论:TALL患者外周血TCRVγ和部分Vδ亚家族谱系出现限制性表达和克隆性增殖。同时存在克隆性增殖γδ+T细胞提示可能为γδ+白血病性T细胞克隆。【关键词】T细胞急性淋巴细胞白血病;T细胞受体Vγ基因;T细胞受体Vδ基因;克隆性　　T细胞受体（Tcellreceptor,TCR）是T细胞识别外来抗原并与之结合的特异性受体,TCR包括有α、β、γ和δ四种肽链

3、,以两种形式存在,它们是由二硫键连接的异二聚体包括α/β,或γ/δ蛋白链。在前T细胞中,TCRγ和δ基因处于无功能的胚系结构状态,在它们分化成熟的过程中发生重排形成功能性TCRγ和δ基因,每一个TCR胚系基因包括可变区（V区）、结合区（J区）和恒定区（C区）等基因片段,其中TCRδ基因还包含多样区（D区）。TCRγ和δ基因它们在重排过程中形成一高度可变区VN（DN）J区（TCRγ没有D区）称为互补决定区3（plementaritydeterminingregion3,CDR3）,是识别抗原的区域,由于N区插入的长短不同,不同重排（不同克隆）的C

4、DR3长度不同。根据这一特点,通过检测Vγ和δ亚家族的CDR3长度,可以了解机体T细胞不同亚家族的分布及其克隆性［1］。我们前期研究发现TALL患者存在TCRVβ亚家族单克隆T细胞,可能为肿瘤性克隆,但也在部分患者中未能检测到克隆性增殖T细胞,考虑可能存在其他类型的TALL［2］,故本研究进一步分析TALL患者外周血单个核细胞中Vγ和Vδ亚家族的分布及其克隆性增殖等情况。　　1材料和方法　　1.1材料经细胞形态学、组织化学和细胞免疫学准确诊的TALL患者9例（编号S1～S9）,年龄4～71岁（中位年龄21岁）,其中男7例,女2例。肝素抗凝

5、收集各样本外周血,常规方法分离单个核细胞,10例正常人作为对照。RNAzol试剂盒购自Gibco/BRL公司;随机引物和反转录酶试剂盒（Poega公司;高质量的去离子甲酰胺(HiDiFormamide)、GeneScan500(LIZ)SizeSTDKit和POP4(PerformanceOptimizedPolymer4)胶均购自美国PerkinElmer公司。　　1.2方法　　1.2.1RNA提取和cDNA合成按常规方法用RNAzol试剂盒提取所收集的外周血单个核细胞的RNA,并应用随机引物和反转录酶试剂盒(Po和CδFam作为基因

6、扫描和序列分析之用［4-6］,引物由德国柏林TIB生物公司合成(表1)。　　1.2.2.2PCR扩增PCR扩增按常规方法进行。总反应体系20μL其中含1μLcDNA产物,任一上游引物和其对应引物(0.5μmol/L),0.1mmol/LdNTP,1.25UTaq聚合酶,1×PCR缓冲液,同时设置阳性和阴性对照。反应在PCR扩增仪(Biometra,德国)中进行,共进行40个循环,94℃1min(首次为3min);退火60℃1min;延伸72℃1min(末次为10min),反应结束后于4℃保存。PCR产物于25g/L琼脂糖凝胶(溴化乙锭染色)中电泳

7、分析结果［1］。　　表1用于RTPCR和基因扫描分析的引物序列（略）　　1.2.3.2基因扫描取2μL荧光素Fam标记的PCR产物加入高质量的去离子甲酰胺与GeneScan500(LIZ)SizeStandard按20∶1比例配好的10μL混合液,经94℃变性4min,然后将样品加入96孔板,直接装载到已灌好POP4胶的3100DNA序列分析仪上进行电泳,电泳所采集结果经基因扫描分析软件分析产物的长度和荧光强度,所收集的不同位置和高度的表示产物的大小和含量,峰的形态提示产物的克隆性。当PCR产物中所含的DNA扩增片段大小一致,其电泳时的迁移

8、率完全相同,在同一时间通过扫描,所显示的结果为一单峰图像,提示PCR产物自TCRVγ或Vδ的CDR3序列完全相同的T细胞,即克隆性细胞,