rhoa对人脐静脉内皮细胞体外迁移能力及血管生成能力的影响

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1、bpBSACDNACIPDEPCDMS0DMEMDTTdNTPEBEDlAhrGFPIPTGKbkDaMcAbmgmlnMOPSODPAGEPCRPEGTpmRT-PCRSDSTETrisU英文缩略词表basepairBovineSerumAlbumincomplementaryDNACalfIntestinaIalkalinePhosphataseDiethylPyrocarbonateDimethylSulfoxideDulbeceo’SModifiedEagleMediumDithiothreitoldeoxyribonucleosidetriphosphateEthidiumB

2、romideEthyleneDiamineTeraaceticAcidhumanizedrecombinantGreenFluorescentProteinIsopropyl—D··thiogalactopyranosideKilO．basekilo．daltonMonoclonalAntibodymilligramminute3。(N-morpholino)propanesulfonicacidOpticalDensityPolyacrylamidgelelectrophoresisPolymeraseChainReactionPolyethylene班ycolroundpermin

3、uteReverseTranscriptionPolymeraseChainReactionSodiumDodecylSulfate1lis-HCI．EDTAbuffer2-amino一2一(hydroxymethyl)一1．3一propanediolUnit第一部分RhoA对人脐静脉内皮细胞体外迁移能力及血管生成能力的影响华中科技大学同济医学院硕士学位论文中文摘要目的：研究人脐静脉内皮细胞(HUVE)中RhoA表达情况，构建含有RhoA全长的真核表达载体PEGF—C1．RhoA，通过脂质体介导转染人脐静脉内皮细胞，稳定筛选得到高表达RhoA的克隆；观察细胞RhoA的核酸和蛋白质表达水

4、平与细胞体外迁移能力、体外血管样组织生成能力的相关性，从而探讨RhoA在内皮细胞迁移及血管生成过程中的作用。方法：采用RT-PCR和Westernblot检测HUVE中RhoA的mRNA及蛋白表达水平。运用分子克隆技术构建RhoA真核表达载体PEGF．C1．RhoA，以脂质体介导转染人脐静脉内皮细胞(HtrVE)，通过G418稳定筛选得到高表达RhoA的细胞克隆，以转染空白载体PEGF．C1的细胞作为对照，扩大培养后以RT-PCR和Westernblot检测细胞转染前后RhoA的mRNA及蛋白表达。以划痕愈合实验检测细胞体外迁移能力；以罗丹明标记的鬼笔环肽进行细胞染色后在激光共聚焦显微

5、镜下观察细胞骨架的变化；以胶原基质胶三维培养检测脐静脉内皮细胞体外血管生成能力。结果：转染真核表达载体PEGF．C1．RhoA并经稳定筛选后的人脐静脉内皮细胞与转染空载体PEGF—C1的对照组比较，RhoA的mRNA和蛋白质表达水平明显升高。实验组和对照组RhoA的表达丰度(RhoA／GA_PDH)分别为12．Ol±1．72和6．81±1．24，两组差异具有显著意义(P<0．05，n-----3)；蛋白质水平，实验组和对照组RhoA的表达丰度(RhoA／13．aetin)分别为4．8l±0．56和3．02±0．32，两者差异亦具有显著意义(P

6、胞骨架发生明显改变，表现为F．actin纤维丝明显增粗，细胞间连接增多，细胞形态发生明显改变，由多角形变成梭形，伪足明显增多；体外迁移能力明显增强；细胞于三维培养基中培养，5天后在倒置显微镜下观察，实验组与对照组各随机取6个高倍镜视野对血管样结构计数，实验组为5．0l±1．48，对照组为1．72--+1．05，两2华中科技大学同济医学院硕士学位论文者差异显著(尸<0．05，以=6)，表明实验组细胞体外血管形成能力明显增强。结论：在人脐静脉内皮细胞中，RhoA高表达导致细胞骨架发生变化，细胞形态发生改变，同时使人脐静脉内皮细胞体外迁移能力及血管形成能力增强。关键词：RhoA；人脐静脉内皮

7、细胞；细胞迁移：血管形成华中科技大学同济医学院硕士学位论文TheEfiectofRhoAonHumanUmbilicalVreinEndothelialCellMigrationandAngiogenesisinVitroABSTRACTobjective：Angiogenesis，theformationofnewbloodvesselsfromexistingones。playsessentialrolesinwoundhealing,tu