胃癌病理特征与hif-1α和vegf+mrna表达水平的关系

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1、万方数据山东大学硕士学位论文材料与方法一、实验材料1、组织来源我们选择2014—2015年在单县中心医院普通外科三病区接受手术治疗的67例胃癌病人，该67例病人均经术后病理确诊为胃癌，并进行分期，患者术前全部行胃镜取活组织病理(所有患者己知情同意，并经伦理委员会批准)。在胃镜检查中，每个病人分别至少取胃癌组织及周围正常粘膜组织(距肿瘤边缘大于5cm6块进行活检，取其中4块液氮保存以备RNA提取和RT—PCR之用。余组织保存于4％多聚甲醛以备病理检查。2、主要试剂Taq酶NEB公司DNAMarkerTakara公司1KPIUsDNAlader天根生化

2、科技有限公司dNTP生工生物工程公司胰酶HYCIOne公司CDNA第一链合成试剂盒GibiCOl公司TRIZOInVitrogen公司3、生化试剂生化基础试剂如氯化钠、EB、氯仿均由实验室提供。PCR引物合成、测序均由Takara公司完成。4、实验仪器稳压电泳仪上海西巴斯PCR仪美国赛默飞世尔公司荧光显微镜及照相系统日本OIymPUS公司低温高速离心机日立公司二、实验方法万方数据山东大学硕士学位论文(一)主要溶液配制1、5xTBE取Tris碱549，硼酸27．59，EDTA4．659，加水溶解至1L。2、1％琼脂糖凝胶取琼脂粉19，加入TBE至10

3、0mL，微波炉内高温溶解，待温度降低至50。C以下加入O．5pg／mLEB20pL混匀后倒入板中。(二)总RNA提取1、组织匀浆：(1)取出经高压锅高压蒸汽灭菌的研钵，将此前存放于液氮内的组织切60mg放入上述容器内，并置入少量液态氮气，将冰冻组织研碎。(2)每份均浆组织标本中加入1mlTRIZOL。(3)上述标本即为匀浆组织，置入小的eppendorf管内，于设置为20。C的恒温箱内静置5分钟。2、相分离：在上述匀浆液内加入氯仿，盖严后在振荡器内震荡15秒，常温放置2分钟，取离心力120009，在冷冻离心机内，2。C离心15分钟。离心后分成三层。

4、RNA即存在于水相中。3、沉淀RNA：上层呈现水相，将其水相转移到另一管中，加入异丙醇002ml，昌常温静置10分钟，将EP管以上步骤离心环境离心10min。4、RNA洗涤：离心后，将上清液小心吸出，EP管内加入75％酒精1mI洗涤沉淀，将EP管租入振荡器并混匀，同上步骤离心。5、RNA再溶解：离心后，将上清液小心吸出，常温放置10min，干燥沉淀物沉淀物即为RNA。取溶解用水20pl，并用微量移液器反复吹打多次，混匀沉淀，放置于恒温箱内，设置温度为60℃，放置10分钟。6、测浓度：取21J!储存液加入另一个EP管中，再加入981JI无RNase水

5、，离心混匀，以无RNase水作空白对照，测OD260／280值。1OD=401JgRNA。OD260／280值在1．8．2．0视为合格样品。(三)引物引物序列如表1，引物合成及测序均由Takatra公司完成。万方数据山东大学硕士学位论文引物序列珏【F—la上游下游VEGF．J上游下游GA纠D匮p上游下游5’．()四GCACTcA艘cAAGAAGTTGC．3’5．．rI℃饿CTC聊T。I’{GG％AGG∞’5LGCAG从麟TCA鼢AGTGG．3’5’戈CAAoG泓GW掰G订掰G-3’5’-AACGGATITGGTcGTA玎GGG．3’5’一ToGCI

6、℃C％G从∞GGT∞3’(四)第一链CDNA合成1、根据纯度计算，将微量离心管内放入5I】g的RNA混悬液，补充DEPC水，使反应体系达到11IjI。在管中加10pMOligo(dT)12—181IJI，轻轻混匀、离心；2、70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min；然后加入下列试剂的混合物：10xPCRbuffer2pl；25mMMgCl22UI；10mMdNTPmixpl；0．1MDTT2pl。予以轻轻混匀，离心。42。C孵育5min，3、加入SuperscriptIT1Ijl，在42。C水浴中孵育50min；4、于70℃加热

7、15min以终止反应；5、将管插入冰中，加入RNaseH1IJI，37。C孵育20min，降解残留的RNA。一20℃保存备用。(五)PCR反应1、取0．5mlPCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA2IJI；上游引物(10pM)2pl；下游引物(10pM)2IJI；dNTP(2mM)4pl；10xPCRbuffer5pl；Taq酶(2u／IJI)1UI。2、加入适量的ddH20，使总体积达50lJI。轻轻混匀，离心；3、PCR反应程序如下：万方数据山东大学硕士学位论文94vC5mln：94℃，30s、l60。C，30sL30cycles72℃，1

8、min—J72℃，15min；4℃保存。4、电泳鉴定：取产物5pL，将上述产物6xLoadingBuffer5pL仔细用移