家蚕一未知基因的研究

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1、浙江理工人学硕十学位论文家蚕一未知基因的研究摘要在对家蚕蛹eDNA文库测序分析中，发现一个编码家蚕未知功能蛋白的eDNA序列，并将其命名为BmWZ。生物信息学分析发现，该eDNA序列全长为506bp，含有一个长255bp的开放阅读框(ORF)，其编码的蛋白质为未知，全长84个氨基酸残基，预测其相对分子质量为9．7kD，等电点为4．54。PCR扩增其ORF，回收产物经BamHI和Hind1II双酶切后，克隆到融合表达载体pET-28a(+)相应的酶切位点上，得到重组质粒pET-28时)．BmWZ。经PCR、双酶切鉴定以及测序证明

2、重组正确。将构建的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株感受态细胞，用终浓度为0．8mM的IPTG诱导重组菌后，超声裂解菌体作SDS．PAGE分析，在13．3kD左右的位置有一条特异性蛋白条带，与预期值(融合标签为3．6kD，BmWZ9．7kD)相符，融合蛋白以包涵体形式存在。大量表达时用超声裂解菌体分离并纯化包涵体：对包涵体进行溶解和梯度透析复性；采用亲和层析纯化His—BmWZ融合蛋白。以纯化所得蛋白为抗原免疫雄性新西兰兔，制备了该重组蛋白的多克隆抗体。ELISA检测该抗血清的效价可达到1：6400以上。Western

3、blotting实验进一步验证了目的蛋白的表达。在亚细胞定位中，发现该蛋白主要存在于在细胞核中。关键词家蚕：BmWZ；亚细胞定位浙江理工人学硕+学位论文ResearchonaNewGenefromsilkworm(Bombyx肌D呐AbstractFromalarge—scalesequencingofeDNAlibraryofsilkwormpupa,aeDNAwhichencodesafunctionunknownproteinnamedBmWZwasidentified．1klengthoftheeDNAis506bp．

4、TheBmWZORFis255bpandencodesaprotein、析tll84aminoacidresidueswhosepredictedmassis13．3kDandpIis4．54．ThePCRproductofORFWaspurified，anddigested谢mBamHIandHindⅢ，theDNAfragmentWasinsertedintotheexpressionvectorpET-28a(+)．TherecombinantplasmidwastransformedintoE．coliBL21(DE3

5、)．PCR,digestion、析tllBamHI／Hind[IIandsequencingconformedthatthetargetfragmentwasinsertedcorrectly．RecombinantproteinWasexpressedsuccessfullyinE．coilBL21(DE3)afterinducedbyIPTG、析ththeconcentrationof0．8mM．TheanalysisofSDS—PAGEshowedthatthefusionproteinBmWZWasexpressedh

6、ie,b#inBL21(DE3)、析minclusionbodyform．Afterbeingdenaturedandrenatured，BmWZWaspurifiedbyNi—affinitychromatography．ThepurifiedfusionproteinWasusedtoimmunizeamaleNewZealandrabbit．ThepolyclonalantibodyWasgeneratedandthetiterWasl：6400measuredbyELISAafterpurifiedbyaffinity

7、chromatographyusingimmobilizedproteinA．WesternblottinganalysisshowedthattheantibodycouldbindBmWZ．TheresultofsubcellularlocalizationindicatedtllatBmWZwasmainlydistributedinthenucleus．Keywords：Bombymori；BmWZ；subcellularlocalizationII浙江理工大学硕士学位论文ACN套固BSADAPIEDTAELISAES

8、TFCAF认IPTlGKanNCBIoRFPCRPIacetonitrileammoniumpersulfate缩略语乙腈过硫酸铵bovineserumalbumin牛血清白蛋白2—(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidinedihydrochl