未知基因验证

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1、现在，研究人员开发出一种在酵母中分析这种基因功能的新方法。研究人员用一种可热诱导的“Degron”来标记一个目标蛋白，标记物使得该蛋白在37摄氏度易发生蛋白水解，而且，当一个重要蛋白在活体中被破坏时，可对由该蛋白功能损失所产生的结果进行判别。研究人员采用这种方法来筛选细胞周期演进中的缺陷，在酵母中识别出三种DNA复制因子。双链RNA对基因表达的抑制及其应用   细胞中存在的绝大多数RNA分子都是单链的，在遗传信息传递及蛋白质合成过程中发挥作用。DsRNA通常是感染细胞的病毒在复制过程中RNA合成的中间产物或一些DNA序列两条互补链转录产物相互结合的副产物。早期的研究揭示dsRNA会通

2、过干扰素途径诱导产生一种蛋白激酶从而抑制被感染细胞中的蛋白质合成，但并不清楚dsRNA如何影响受感染细胞的正常基因表达及其功能。   RNAi（RNAinterference）是指外源性双链RNA（dsRNA）能抑制细胞内与其序列同源的基因的表达，在进化上，这可能是生物调控基因表达及抵御病毒侵染或转座子诱导DNA突变的一种共有的生理机制。自1998年Fire证明RNAi可被应用于研究线虫基因的功能以来，已取得了巨大的进展。尤其是在人类及小鼠基因组计划相继完成，研究的重心已从大规模测序阶段转移到功能基因组的背景下，我们面临的是如何诠释这些遗传信息、如何将这些序列信息与生物学功能关联起来

3、。而RNAi为我们研究未知功能的基因提供了新的反向遗传学手段，同时在人类基因治疗方面具有潜在的应用价值。   在未知功能基因的研究中，常用的反向遗传学手段包括基于同源重组的基因敲除及利用负链RNA与同源mRNA通过碱基互补结合，从而阻止其翻译或触发降解机制的反义RNA抑制两种手段，并都已成功地应用于一些功能基因的研究。但这两种方法都不能完全满足日益增长的研究需求。如，基因敲除能从根本上消除目标基因的活性，是经典的反向遗传学手段，但由于常规的基因敲除试验需要：（1）构建含突变位点的目标基因载体；（2）导入胚胎干细胞（ES）细胞；（3）筛选含重组构件的ES细胞；（4）将上述ES细胞注入囊

4、胚腔；（5）通过嵌合体F1代自交以产生带突变纯合体的F2代，这往往需要几个月的时间，不利于在短期内研究数量较多的未知功能基因。同时，若希望一次性敲除两个或多个基因，对于基因敲除也是一大难题。此外，若希望研究某一突变致死基因在特定胚胎发育阶段的功能，基因敲除可能也无法满足研究的需求，因为胚胎可能在早期就因为缺失此基因而死亡。在某些制造基因敲除动物模型十分困难或因伦理学原因根本就不可能进行的物种中（如大型动物及人），基因敲除也无法应用。   对于反义RNA抑制手段，虽然应用于果蝇中已取得了较好的效果，但在爪蟾（Xenopus）、斑马鱼（Zebrafish）及小鼠胚胎中反义RNA不能稳定可

5、靠地降低目标基因（例如Mos，Plat）的表达。同时，由于反义RNA技术对内源性基因表达的抑制较弱，往往产生过渡性的表型，这也妨碍了我们对目标基因功能的准确判断。   RNAi可以有效地弥补基因敲除与反义RNA抑制的不足。由于RNAi作用比反义RNA技术更有效，更持久；比基因敲除更省时，可在短期内对多个基因进行研究（如探讨与果蝇已知序列染色体上所有开放阅读框相关联的表型）；通过导入多种dsRNA，可以研究一系列基因的功能及他们之间的相互关系，特别是研究母源性mRNA对卵母细胞及胚胎后继发育的影响具有其他方法无法比拟的优势，因此具有广阔的应用前景。最近，Elbashir使用21bpds

6、RNA避免了干扰素引起的细胞非特异性应激反应，实现了在一系列哺乳类细胞系中，包括人类Hela及胚胎性肾细胞系293中dsRNA对特定基因表达的抑制作用，进一步扩大了RNAi的应用范围，并为利用dsRNA进行基因治疗提供了实验依据。   尽管许多基因RNAi的表型与其基因敲除后的表型吻合得很好，但RNAi并不适用于所有的基因，如dsRNA对一些在神经细胞中发挥功能的基因抑制作用不明显。同时，dsRNA会抑制细胞内所有具序列同源性的基因表达，因此与RNAi相关联的表型可能反映了一个基因家族中几个高度相关的基因缺失所导致的共同表型，而不仅仅是某一个特定的基因。此外，一些不相关基因也有可能因

7、为局部序列的相似性而成为dsRNA的抑制作用对象。但上述问题都可以通过合理的dsRNA设计加以克服。此外，虽然dsRNA能有效抑制目标基因的表达，但必须意识到dsRNA的抑制作用是在转录后水平上实现的，并不是完全的。因此，RNAi作用后，一些基因依然可能保持低水平的基因表达。在研究未知基因的功能时必须考虑到RNAi的这些特点。   问题与展望   dsRNA能特异性抑制同源基因表达的发现引起了越来越多研究者的兴趣。目前对于RNAi的作用机制已有了较深入的认