基因功能的验证.doc

《基因功能的验证.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、miR-532功能的初步研究之前的工作表明，在红系分化过程中miR-532具有广泛的调控作用，如下图（未发表数据）：功能研究的常见流程：找到感兴趣的基因→构建过表达或敲低的克隆→转染细胞获得过表达或敲低的细胞系→验证过表达或敲低是否成功→检测相关基因的表达水平→观察是否有表型变化→更好的研究模型上确定该基因的功能→机制的探索→各种方法证明机制→。。。。。。你需要做的：在293T和K562细胞中初步探索miR-532的调控情况。一、293T细胞1、复苏并培养293T细胞。另外记得要及时冻存细胞。2、pcDNA和

2、pcDNA-miR-532分别转染293T细胞。1）转染只需6孔板中进行；2）转染步骤，质粒、试剂的用量等请参考以前的实验记录和Lipo2000官方protocol；3）48小时后用TRIZOL收细胞，提RNA。3、验证过表达是否成功。1）分别取293T-pcDNA和293T-pcDNA-miR-532的RNA1ug，加poly（A）尾，再用特殊的引物反转录，获得cDNA。（这与我们平时反转录获得的cDNA不一样，姑且叫mi-cDNA）。2）qPCR:模版为293T-pcDNA和293T-pcDNA-miR-

3、532的mi-cDNA，target（引物）为U6和miR-532。1）如果结果表明miR-532过表达成功，则进入下一步。4、检测红系相关基因的表达。主要就是qPCR，模版为293T-pcDNA和293T-pcDNA-miR-532的cDNA，target（引物）为GAPDH，多个珠蛋白基因，GATA-1和KLF1。二、K562细胞步骤基本同上，需要注意的是：1、K562为悬浮细胞，培养方法不同2、转染K562细胞采用的是电转的方法。