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时间:2019-02-01
《家蚕一未知基因的研究》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、浙江理工人学硕十学位论文家蚕一未知基因的研究摘要在对家蚕蛹eDNA文库测序分析中,发现一个编码家蚕未知功能蛋白的eDNA序列,并将其命名为BmWZ。生物信息学分析发现,该eDNA序列全长为506bp,含有一个长255bp的开放阅读框(ORF),其编码的蛋白质为未知,全长84个氨基酸残基,预测其相对分子质量为9.7kD,等电点为4.54。PCR扩增其ORF,回收产物经BamHI和Hind1II双酶切后,克隆到融合表达载体pET-28a(+)相应的酶切位点上,得到重组质粒pET-28时).BmWZ。经PCR、双酶切鉴定以及测序证明
2、重组正确。将构建的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株感受态细胞,用终浓度为0.8mM的IPTG诱导重组菌后,超声裂解菌体作SDS.PAGE分析,在13.3kD左右的位置有一条特异性蛋白条带,与预期值(融合标签为3.6kD,BmWZ9.7kD)相符,融合蛋白以包涵体形式存在。大量表达时用超声裂解菌体分离并纯化包涵体:对包涵体进行溶解和梯度透析复性;采用亲和层析纯化His—BmWZ融合蛋白。以纯化所得蛋白为抗原免疫雄性新西兰兔,制备了该重组蛋白的多克隆抗体。ELISA检测该抗血清的效价可达到1:6400以上。Western
3、blotting实验进一步验证了目的蛋白的表达。在亚细胞定位中,发现该蛋白主要存在于在细胞核中。关键词家蚕:BmWZ;亚细胞定位浙江理工人学硕+学位论文ResearchonaNewGenefromsilkworm(Bombyx肌D呐AbstractFromalarge—scalesequencingofeDNAlibraryofsilkwormpupa,aeDNAwhichencodesafunctionunknownproteinnamedBmWZwasidentified.1klengthoftheeDNAis506bp.
4、TheBmWZORFis255bpandencodesaprotein、析tll84aminoacidresidueswhosepredictedmassis13.3kDandpIis4.54.ThePCRproductofORFWaspurified,anddigested谢mBamHIandHindⅢ,theDNAfragmentWasinsertedintotheexpressionvectorpET-28a(+).TherecombinantplasmidwastransformedintoE.coliBL21(DE3
5、).PCR,digestion、析tllBamHI/Hind[IIandsequencingconformedthatthetargetfragmentwasinsertedcorrectly.RecombinantproteinWasexpressedsuccessfullyinE.coilBL21(DE3)afterinducedbyIPTG、析ththeconcentrationof0.8mM.TheanalysisofSDS—PAGEshowedthatthefusionproteinBmWZWasexpressedh
6、ie,b#inBL21(DE3)、析minclusionbodyform.Afterbeingdenaturedandrenatured,BmWZWaspurifiedbyNi—affinitychromatography.ThepurifiedfusionproteinWasusedtoimmunizeamaleNewZealandrabbit.ThepolyclonalantibodyWasgeneratedandthetiterWasl:6400measuredbyELISAafterpurifiedbyaffinity
7、chromatographyusingimmobilizedproteinA.WesternblottinganalysisshowedthattheantibodycouldbindBmWZ.TheresultofsubcellularlocalizationindicatedtllatBmWZwasmainlydistributedinthenucleus.Keywords:Bombymori;BmWZ;subcellularlocalizationII浙江理工大学硕士学位论文ACN套固BSADAPIEDTAELISAES
8、TFCAF认IPTlGKanNCBIoRFPCRPIacetonitrileammoniumpersulfate缩略语乙腈过硫酸铵bovineserumalbumin牛血清白蛋白2—(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidinedihydrochl
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